Активационный апоптоз субпопуляций Т-лимфоцитов при ишемической болезни сердца тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, кандидат медицинских наук Юдин, Александр Александрович

• Юдин, Александр Александрович
• кандидат медицинских наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Юдин, Александр Александрович

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Активация Т-лимфоцитов: пролиферация и апоптоз

1.2. Апоптоз Т-лимфоцитов: механизмы развития и проявления

1.3. Активационный апоптоз Т-лимфоцитов

1.4. Роль иммунных механизмов в развитии атеросклероза и ишемической 20 болезни сердца

1.5. Малые действующие дозы как общебиологическая закономерность

1.6. Действие на иммунную систему малых доз ионизирующего облучения

1.7. Клинико-эпидемиологическая характеристика облученных малыми дозами

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Клиническая характеристика больных

2.2. Клинические лабораторные методы исследования

2.3. Инструментальные методы исследования

2.4. Реактивы

2.5. Получение крови и сыворотки

2.6. Проверка жизнеспособности клеток

2.7. Оценка содержания лимфоцитов

2.8. Выделение мононуклеарных клеток методом одноступенчатого градиента 46 плотности фиколл-урографина

2.9. Культивация лимфоцитов в течение 72 часов

2.10. Культивация лимфоцитов в течение 18 часов

2.11. Моноклональные антитела и проточная лазерная цитометрия

2.12. Определение субпопуляций лимфоцитов

2.13. Оценка апоптоза лимфоцитов

2.14. Определение количественного содержания С-реактивного белка, антител 56 к двуспиральной ДНК, антител к фосфолипидам (

§0, ^М), антител к кардиолипину (^А) в сыворотке крови

2.15. Статистическая обработка данных и дополнительные параметры оценки 60 экспериментальных значений апоптоза

Глава 3. Результаты собственных исследований

3.1. Результаты клинического обследования больных

3.1.1. Клинико-функциональная характеристика больных атеросклерозом 63 магистральных артерий

3.1.2. Клинико-функциональная характеристика больных ишемической 66 болезнью сердца

3.2. Результаты иммунологического обследования больных

3.2.1. Распределение основных субпопуляций Т-лимфоцитов у обследованных 76 больных

3.2.2. Распределение С095+-клеток (Fas-экспрессия) у обследованных больных

3.2.3. Изучение спонтанного и индуцированного ФГА апоптоза, его 84 неравномерность среди субпопуляций лимфоцитов у обследованных больных

3.2.4. Изучение концентрации СРБ и уровня антител к кардиолипину у 94 обследованных больных

3.2.5. Изучение показателей активационного апоптоза субпопуляций Т- 98 лимфоцитов под влиянием терапии статинами и ß-блокаторами

Глава 4. Обсуждение результатов

Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Активационный апоптоз субпопуляций Т-лимфоцитов при ишемической болезни сердца»

Актуальность проблемы

Ишемическая болезнь сердца является одной из наиболее распространенных патологий сердечно-сосудистой системы, на долю которой приходится до 50% всех случаев смерти. Морфологической основой ИБС является атеросклеротическое повреждение коронарных артерий. В настоящее время атеросклероз рассматривается как неспецифический системный воспалительный процесс, развивающийся в ответ на повреждающее действие дислипидемии и других факторов риска (артериальная гипертензия, курение, гиподинамия, метаболические нарушения).

В последние годы активно ведутся исследования, касающиеся роли иммунной системы в патогенезе атеросклероза [Stemme S., 1994, Hansson G.K., 2002]. Воспалительный процесс, протекающий в атеросклеротических бляшках, привлекает различные клеточные элементы, и, в частности, Т-лимфоциты: в основном CD4+-T-лимфоциты, при небольшом уровне С08+-лимфоцитов, а также NKT лимфоцитов [Пигаревский П.В., 2002]. Активация иммунного ответа осуществляется за счет стимуляции неоантигенами (апоптотические клетки и окисленные ЛПНП). В атеросклеротическом процессе клетки иммунной системы участвуют по одному из трех механизмов: межклеточное взаимодействие между антигенпредставляющими клетками (макрофаги, B-лимфоциты или дендритные клетки) и Т-лимфоцитами; секреция различных цитокинов активированными Т-лимфоцитами, модулирующих активность макрофагов в атеросклеротической бляшке; продукция различных антител (включая аутоантитела) B-лимфоцитами по Т-зависимому или Т-независимому механизмам. Некоторые из антител обладают свойством блокировать взаимодействие окисленных ЛПНП и scavenger-рецепторов макрофагов.

В процессе атерогенеза иммунная система выступает, с одной стороны, как индуктор воспаления в стенке артерии, а с другой стороны, факторы повреждения сосудов могут вызывать различные изменения в иммунной системе, такие как дисбаланс субпопуляций Т-клеток, функциональные нарушения активации лимфоцитов. От степени активационного потенциала лимфоцитов in situ зависит модулирование воспалительного процесса, протекающего в атеросклеротической бляшке: ее дальнейший рост и нестабильность.

Существует мнение, что функциональная недостаточность лимфоцитов, сопровождающаяся высокой долей апоптоза клеток иммунной системы, может привести к преждевременному старению организма. [Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н., 1999, Ярилин

A.A., 2003]. Вместе с тем, усиление апоптотической гибели лимфоцитов, вызывая нарушения регуляции иммунного ответа, может оказывать влияние на атерогенез. Однако, в настоящее время активационный апоптоз лимфоцитов остается мало изученным, а его роль в развитии атеросклероза до сих пор не выяснена.

Большой интерес представляет изучение активационного апоптоза субпопуляций лимфоцитов у больных, подвергшихся воздействию малых доз ионизирующего облучения, учитывая быстрое прогрессирование ИБС у этих пациентов.

Все выше изложенное послужило основанием для проведения настоящего исследования.

Цель исследования

Цель настоящей работы - изучение активационного апоптоза Т-лимфоцитов при атерогенезе у больных ИБС. Задачи исследования

1. Сформировать клинические группы больных, отражающие прогрессирование атеросклероза коронарных артерий.

2. Определить субпопуляционный состав Т-лимфоцитов у пациентов с атеросклерозом магистральных артерий и ИБС.

3. Оценить выраженность спонтанного раннего и позднего апоптоза субпопуляций Т-лимфоцитов (CD4 , CD8 ), а также чувствительность к индукции позднего апоптоза Т-лимфоцитов (CD4+, CD84), активированного ФГА, у пациентов с атеросклерозом магистральных артерий и ИБС.

4. Изучить неравномерность апоптоза CD4+, CD8+ Т-лимфоцитов при прогрессировании атеросклероза коронарных артерий.

5. Определить зависимость между активационным апоптозом CD4+, CD8+ Т-лимфоцитов и концентрацией СРБ, а также уровнем AT к кардиолипину.

6. Изучить влияние гиполипидемической терапии статинами на активационный апоптоз субпопуляций Т-лимфоцитов у больных ИБС.

7. Оценить особенности клинической картины заболевания, субпопуляционного состава лимфоцитов, чувствительности к апоптозу и его неравномерности у больных ИБС, подвергшихся воздействию малыми дозами ионизирующего облучения.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное клинико-иммунологическое исследование с оценкой активационного апоптоза лимфоцитов у больных атеросклерозом магистральных артерий и ИБС, в т.ч. у пациентов, подвергшихся воздействию малыми дозами ионизирующего облучения.

Впервые установлена зависимость активационного апоптоза СЭ4+ и СБ8+ Т-лимфоцитов от степени выраженности атеросклероза коронарных сосудов, в отличие от показателей спонтанного раннего и позднего апоптоза.

Впервые показана неравномерность активационного апоптоза среди субпопуляций Т-лимфоцитов при прогрессировании атеросклероза коронарных артерий у больных ИБС, причем степень этой предпочтительности меняется от высокой доли СБ8+ Т-лимфоцитов, до высокой доли СБ4+ Т-лимфоцитов среди апоптотической фракции клеток.

Впервые показано влияние гиполипидемической терапии статинами на чувствительность к активационному апоптозу субпопуляций Т-лимфоцитов у больных ИБС.

Разработана методика подсчета неравномерности активационного апоптоза Т-лимфоцитов на основании средних значений активационного индекса.

Впервые установлено соответствие между чувствительностью к активационному апоптозу субпопуляций лимфоцитов и уровнем СРБ, а также АТ к кардиолипину при прогрессировании ИБС.

Впервые выявлены клинико-иммунологические особенности ИБС у больных, подвергшихся воздействию малыми дозами ионизирующего облучения.

Практическая значимость диссертации

Выявленные особенности функциональной активности Т-лимфоцитов, на различных стадиях атеросклероза коронарных артерий позволили уточнить его патогенез.

Полученные результаты позволяют рекомендовать определение активационного апоптоза субпопуляций Т-лимфоцитов с целью уточнения выраженности атеросклеротического процесса и оценки риска сосудистых осложнений у больных ИБС.

Определены иммунологические параметры активационного апоптоза на примере созданной клинической модели прогрессирования коронарного атеросклероза. Эта модель может быть использована', в различных сравнительных исследованиях с применением лекарственных препаратов, а также при изучении сопутствующих хронических иммунопатологических процессов.

Выявленные клинико-иммунологические особенности развития атеросклероза коронарных артерий у больных ИБС, подвергшихся воздействию малыми дозами ионизирующего облучения, обосновывают целесообразность более «агрессивного» применения статинов у этой группы пациентов, начиная с доклинической стадии заболевания.

Обнаруженные взаимосвязи развития атеросклероза и функциональной активности клеток иммунной системы обосновывают применение рекомбинатных цитокинов (Тврр) и рекомбинатных молекул адгезии (Е-селектин) как стабилизаторов мембран эндотелиальных клеток коронарных сосудов.

Внедрение результатов исследования

Метод оценки степени неравномерности активационного апоптоза субпопуляций лимфоцитов при прогрессировании ИБС используется в научном и учебном процессе кафедры иммунологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. Определение параметров активационного апоптоза введено в терапевтических отделениях Центральной клинической больницы РАН и научно-консультативного отделения клиники ГНЦ Института Иммунологии ФМБА для оценки риска сосудистых осложнений.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы докладывались на научных заседаниях кафедр иммунологии и внутренних болезней с курсом функциональной и ультразвуковой диагностики МБФ ГОУ ВПО РГМУ, на клинических конференциях ЦКБ РАН, Объединенном иммунологическом форуме (г. Екатеринбург, 2004), Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия» (г. Курск, 2006).

Публикации

Основные положения диссертационного исследования отражены в 6 публикациях.

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Юдин, Александр Александрович

выводы

1. У больных ИБС по мере прогрессирования заболевания в периферической крови достоверно (р<0,05) возрастают абсолютные и относительные показатели CD8+CD25+ Т-лимфоцитов при отсутствии изменений показателей CD3+ Т-лимфоцитов, CD4+CD25+ регуляторных Т-клеток и субпопуляций CD3+CD16+CD56+ NKT клеток.

2. Ранний и поздний спонтанный апоптоз Т-лимфоцитов не отражают прогрессирования ИБС и не коррелируют с такими маркерами воспаления атеросклеротического процесса, как С-реактивный белок и антитела к кардиолипину.

3. Прогрессирование ИБС сопровождается значимыми (р<0,05) изменениями чувствительности Т-лимфоцитов к позднему активационному апоптозу в ответ на стимуляцию клеток ФГА in vitro: достоверным повышением для CD3+CD4+- и снижением для CD3+CD8+ Т-лимфоцитов. Усиленное вовлечение в апоптоз CD3+CD4+ Т-клеток соответствует более высокому уровню экспрессии CD95 молекул.

4. У больных хроническими формами ИБС определяется различная избирательность вовлечения субпопуляций Т-лимфоцитов в активационный апоптоз. Неравномерность апоптоза на ранних стадиях атерогенеза коронарных артерий' выражена за счет высокой доли в апоптотической фракции CD8+ Т-лимфоцитов, а прогрессирование ИБС характеризуется преобладанием CD4+ Т-лимфоцитов.

5. Преобладание CD3+CD4+ Т-лимфоцитов в апоптотической фракции клеток при прогрессировании ИБС соответствует повышению уровня в сыворотке крови маркеров атеросклеротического воспаления.

6. Применение гиполипидемической терапии у больных ИБС статистически значимо (р<0,05) снижает чувствительность к активационному апоптозу субпопуляций Т-лимфоцитов.

7. Ранний дебют и быстрое прогрессирование ишемической болезни сердца у пациентов, подвергшихся воздействию малыми дозами ионизирующего облучения, сопровождаются особенностями динамики субпопуляций лимфоцитов и их чувствительности к активационному апоптозу. В отличие от больных основной группы, происходит достоверное (р<0,05) увеличение абсолютного содержания CD3 Т-лимфоцитов, CD3 CD8 -клеток, NKT-лимфоцитов и снижение степени чувствительности к позднему активационному апоптозу с одновременным повышением в сыворотке уровня антител к кардиолипину, что, возможно, способствует формированию аутоиммунных реакций.

8. Активационный апоптоз субпопуляций Т-лимфоцитов периферической крови in vitro отражает динамику атеросклероза коронарных артерий и может рассматриваться как один из важных факторов патогенеза ИБС.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. У больных ИБС рекомендуется исследование чувствительности к активационному апоптозу субпопуляций Т-лимфоцитов с определением его неравномерности для оценки выраженности атерогенеза и риска сосудистых осложнений, а также эффективности проводимой терапии.

2. В комплексную терапию лиц, подвергшихся действию малых доз ионизирующего облучения, целесообразно включение статинов в максимально эффективных дозах как при наличии ИБС, так и в доклиническую стадию заболевания с целью его профилактики.

3. Разработанные методики определения параметров активационного апоптоза и его неравномерности (индекс активационного апоптоза и индекс неравномерности) рекомендуются для применения в клинической практике для оценки влияния лекарственных препаратов на функциональный потенциал лимфоцитов как у больных ИБС, так и при другой патологии.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Юдин, Александр Александрович, 2006 год

1. Альберте Б., Брей Д., Льюис и др. Молекулярная биология клетки. Москва. Издательство Мир (пер. с англ.). -1987. -Т.4. - с. 45.

2. Басанаева Л.Н., Тихонова Л.Н. Анализ смертности ликвидаторов аварии на ЧАЭС за 10 лет наблюдений по данным республиканской больницы ветеранов войн. // Сборник научно-практических работ врачей республики Марий Эл. Йошкар-Ола. - 1999. - Вып. 3.-С.10-13.

3. Биохимия. Под ред. чл.-корр. РАН Е.С. Северина. Геотар-Мед. М. - 2005. - С. 230, 375, 443

4. Блюменфельд Л.А. Понятие конструкций в биологической физике. К вопросу о механизме действия сверхмалых доз. // Российский химический журнал. 1999. -XLIII.,- 5.-е. 15-20.

5. Блюменфельд Л.А., Голданский В.И., Подгорецкий М.И., Чернавский Д.С. // Ж. Структ. химии. 1964. - Т.8. - с. 854.

6. Булдаков Л.А., Ижевский П.В'. Особенности медицинского обслуживания работников атомной промышленности. // Медицина экстремальный ситуаций. -1999-№3.-с. 5-11.

7. Бурлакова Е.Б. Действие сверхмалых доз облучения. // Вестник Российской Академии Наук. 1994. - Т. 64. - с. 425-431.

8. Бурлакова Е.Б. Особенности действия сверхмалых доз биологически активных веществ и физических факторов низкой интенсивности. // Российский химический журнал. 1999. - XLIII. -5.-е. 3-11.

9. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика. Практический курс. Москва. -1999.

10. Василенко И.Я. Изолированный и сочетанные поражения продуктами деления, плутония и урана. // Медицина экстремальных состояний. — 2000. №4(7). - с. 5-10.

11. Василенко И.Я. Повторные поражения продуктами деления ядер урана в малых дозах. // Медицина экстремальных состояний. 1999: - №3. - с. 36-48.

12. Владимиров Ю.А., Рощупкин Д.И., Потапенко А.Я., Деев А.И. Биофизика. М. -Медицина. - 1983.

13. Голденков В.А., Дикий В.В., Лизунова Г.В. Феномен множественной химической чувствительности как следствие воздействия сверхмалых доз. // Рос. хим. ж. -2002. XLVI. - с. 39-45.

14. Гребенюк А.Н., Антушевич А.Е., Беженарь В.Ф., Кира Е.Ф., Легеза В1И., Прокопчук Б.И., Смирнов H.A. Состояние иммунитета при действии комплекса факторов радиационных аварий. // Морской медицинский журнал. 1999. - №3.- с: 40-45.

15. Григорьева Т.Ю. Неравномерность активации и ano птоза субпопуляцийТ-лимфоцитов в норме и при некоторых иммунопатологических процессах. // Диссертация на соискание степени кандидата медицинских наук. М. - 2002. - 114 с.

16. Гуревич-Ильин Г.Я. Общая врачебная техника: // М. Медгиз. - 1943. - с. 283-324.

17. Дифференциальная диагностика и лечение внутренних болезней. Под редакцией чл.-корр. РАМН Е.Е. Гогина. М. 2003. - с. 129-130, 141-161, 197-198:

18. Зайцев С.В., Ефанов A.M.', Сазанов Л.А. Общие закономерности и возможные механизмы действия биологически активных веществ в сверхмалых дозах. // Российский химический журнал. 1999: - XLIII. - 5. с. 28-33.

19. Калистратов B.C., Булдаков Л.А., Нисимов П.Т., Романова И.Б. и др. К вопросу о пороге и стохастических эффектах при воздействии инкорпорированных радионуклидов. // Медицина экстремальных ситуаций. 2001. - №3(10). - с. 44-51.

20. Карпов В.Б. Радиационно-гигиеническая оценка состояния-здоровья отдельных категорий населения; подвергшихся воздействию факторов аварии на ЧАЭС. //

21. Автореферат на соискание ученой степени доктора медицинских наук. СПб. -2001.-42 с.

22. Кейрим-Маркус И.Б. Особенности лучевого канцерогенеза у человека при малых дозах и малой мощности дозы. // Радиац. биол. Радиоэкология. 1998. Т. 38. - с. 672-683.

23. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Воробьев А.А. Эндогенные иммуномодуляторы. — СПб. Медицина. - 1992. - 350 с.

24. Клебанов Г.И., Теселкин Ю.О., Бабенкова И.В. и др. Антиоксидантная активность сыворотки крови. // Вестник РАМН. 1999. - №2. - с. 15-22.

25. Клиническая биохимия. Под ред. акад. РАМН В.А. Ткачука. Изд-во МГУ. Геотар-Мед. М. - 2004. - с. 206-207.

26. Ковальчук J1.B. Антигенные маркеры клеток иммунной системы человека CD (cluster differentiation) система. М. - 2003.

27. Ковальчук J1.B., Соболев Б.Н., Ганковская J1.B., Юдин А.А. Анализ молекулярного взаимодействия в системе: IL-1 (3 IL-IRa - IL-1R. // Иммунология. - 2001. - №1. -с. 6-10.

28. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Хорева М.В., Соколова Е.В. Система цитокинов, комплемента и современные методы иммунного анализа. // М. Изд-во РГМУ. -2001.

29. Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н. Актуальные проблемы оценки иммунной системы человека на современном этапе. // Иммунология. 1990.- N5,- с.4-7.

30. Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н. Апоптогенные механизмы возникновения иммунодефицитных заболеваний. // Журн. микробиол. 1999. №5. - с. 47-52.

31. Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н. и др. Оценка субпопуляций Т-лимфоцитов у человека: Т-супрессоры и Т-помощники. Методические рекомендации. // Изд-во 2-го МОЛГМИ им. Н.И. Пирогова. 1982. - 20 с.

32. Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н. Иммунодефицитные заболевания человека: Обзорная информация. // М. ВНИИМИ. - Сер. "Терапия". - Вып. 4. - 1984,- с. 84.

33. Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н. Иммунорегуляторная роль моноцитов в норме и при иммунопатологии. // М. ВИНИТИ. - Итоги науки и техники. - Сер. "Иммунология". - Т.27. - 1991.- с. 211.

34. Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н. Патогенетический принцип оценки иммунной системы человека: дальнейшее развитие. // Клин. лаб. диагностика. 1995. - № 6. -С. 78-79.

35. Кожановская Я.К., Фоменко Л.А., Газиев А.А. Повышение активности ядерных ДНК-полимераз в тканях мышей, подвергнутых длительному у-облучению. // Генетика. 1990. - Т. 30. - с. 300-304.

36. Комаровская М.Е., Дрык С.И., Кривенко С.И., Карканица Я.В. Влияние рентгеновского облучения на продукцию ИЛ-6 и ФНО-а мононуклеарами периферической крови. // Радиобиология. 1992. - Т. 33. - с. 88-91.

37. Косилова И.В. Клинико-патогенетические особенности формирования патологии миокарда у ликвидаторов аварии на чернобыльской АЭС. // Автореферат на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Ростов-на-Дону. - 2000. -21 с.

38. Куприянов И.Е. Анатомия и гистология лимфоидной ткани серозного перикарда человека. // Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины. М. -1998.-с. 23.

39. Легеза В.И. Ликвидаторы последствий аварии на Чернобыльской АЭС 10 лет спустя. // Терапевтический архив. - 1998. - с. 77-79.

40. Лейко И. А. «Клинико-иммунологическая характеристика жителей Среднего Урала. // Дисс. канд. мед. наук. М. - 2002. - с. 15-16.

41. Литвина М.М. Оценка различных путей активации Т-лимфоцитов при иммунодефицитных состояниях. // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М. - 1996. - с. 29.

42. Литвина М.М., НиконоваМ.Ф., Ярилин A.A. Состояние классического и альтернативного путей активации Т-лимфоцитов у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС. // Радиационная биология. Радиоэкология. 1994. - Т. 34.— Вып. 4-5.-с. 598-602.

43. Лякишев A.A. Лечение гиперлипидемий. // Сердце. 2002. - №3. - с. 113-118:

44. Мазур H.A. Очерки клинической кардиологии. // М. -1999

45. Маколкин В:И., Овчаренко С.И. Внутренние болезни. // М. 1999. - с. 592.

46. Марино П.Л. Интенсивная терапия. // Геотар медицина. — М. 1998. - с.49-59.

47. Маршелл Э. Биофизическая химия. // Мир. М. -1981. - с. 158-160

48. Нагорнев В.А., Яковлева O.A. Микроциркуляция липидов низкой плотности через эндотелий в норме и при атеросклерозе. // Регион, кровообр. и микроцирк. 2002. - №1. - с. 14-20.

49. Нариманов A.A., Корыстов Ю.Н. Стимуляция роста клеток лимфомы человека ионизирующим облучением в малых дозах. // Радиационная биол. Радиоэкология. -1997.-Т. 37.-с. 312-319.

50. Насонов Е.Л. Профилактика и лечение антифосфолипидного синдрома и перспективы. // Русский медицинский журнал. 2004. - Т. 12. - №6. - с. 1-19.

51. Наумов В.Г., Лупанов В.П., Лякишев A.A., Сумароков А.Б., Миронова И.Ю., Козлов С.Г., Габрусенко С.А., Ежов М.В., Сергиенко И.В. Лечение хронической ишемической болезни сердца. Пособие для врачей. // М. 2004. - с.6-9.

52. Никифоров А.М., Каташкова Г.Д., Шишмарев Ю.Н. Ишемическая болезнь сердца у ликвидаторов аварии на ЧАЭС. Ликвидаторы аварии на ЧАЭС. Состояние606366,67,68.69,70.