С1 ингибитор: функциональная активность, количество и аутоантитела в дифференциальной диагностике отеков тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, кандидат биологических наук Андина, Светлана Семеновна

• Андина, Светлана Семеновна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Андина, Светлана Семеновна

Оглавление.

Введение.

Глава 1. Ингибитор первого компонента комплемента.

Обзор литературы).

1.1. Введение.

1.2. Активация системы комплемента.

1.2.1.Классическан система комплемента. Компоненты классического пути активации комплемента.

1.2.2.Регуляция активации системы комплемента по классическому пути.

1.3. Альтернативный путь активации системы комплемента. р 1.4. Фактор J и ингибитор Clq, действующие на С1 компонент комплемента.

1.5. Лектины и лектиновый путь активации системы комплемента.

1.6. Характеристика С1 ингибитора.

1.6.1. Молекулярная характеристика С1 ингибитора.

1.6.2. Физико-химические и биологические свойства С1 ингибитора.

1.6.3. Механизм действия и синтез С1 ингибитора.

1.6.4. Методы выделения С1 ингибитора.

1.6.5. С1 ингибитор и его роль в свертывающей и контактной системах.

1.7. Методы определения активности и количества С1 ингибитора.

1.7.1. Методы определения функциональной активности и количества С1 ингибитора.

1.7.2. Соотношение между количеством и функцией С1 ингибитора in vivo при * наличии дефицитов.

1.8. Дефициты С1 ингибитора при различных заболеваниях.

1.9. Генетические причины возникновения дефицитов С1 ингибитора.

1.10. Молекулярная генетика С1 ингибитора.

1.11. Отеки, природа их возникновения.

1.11.1. Изменения системы комплемента при отеках различного типа.

1.11.2. Классификация отеков.

1.12. Возникновение отеков в результате дефицита карбоксипептидазы N в плазме крови.

1.13. Роль аутоантител в возникновении отеков.

1.14. Купирование отеков (лечение и профилактика).

9 1.14.1. Лечение.

1.14.2. Профилактика наследственного ангионевротического отека.

1.14.3. Подготовка к операциям.

1.14.4. Продолжительность стационарного лечения.

1.14.5.Другие меры профилактики.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1.Биологический материал.

2.2. Прочие материалы.

2.3. Общие методы.

2.3.1. Иммунизация кроликов.

2.3.2. Получение сыворотки крови человека.

2.3.3. Иммунопреципитация по Оухтерлони.

2.3.4. Иммуноэлектрофорез (ИЭФ) в модификации по Шейреггеру.

2.3.5. Определение концентрации С1 ингибитора методом радиальной иммунодиффузии (РИД) поМанчини [129].

2.3.6. Получение конъюгата антител к С1 ингибитору человека с пероксидазой хрена.

2.3.7. Определение разведения полученного конъюгата в прямом тесте, для проведения ИФА.

2.4. Гемолитические методы.

2.4.1. Эритроциты барана.

2.4.2. Приготовление стандартной взвеси бараньих эритроцитов.

2.4.3. Приготовление сенсибилизированных эритроцитов.

2.4.4. Определение активности факторов комплемента гемолитическим. микрометодом.

Глава 3. Собственные методы исследования.

3.1. Методики хроматографического разделения и очистки.

3.1.1. Выделение фракции IgG антител к С1 ингибитору.

3.1.2. Выделение функционально активного Cls из сыворотки крови доноров.

3.2. Определение количества С1 ингибитора методом ИФА.

3.3. Определение функциональной активности С1 ингибитора.

3.3.1. Использование Cls для определения активности С1 ингибитора.

3.3.2. Использование трипсина и химотрипепна для определении активности #» С1 ингибитора.

3.3.3. Определение функциональной активности С1 ингибитора с помощью фибринолизина.

3.4. Определение антител к С1 ингибитору.

Глава 4. С1 ингибитор: функциональная активность, количество и аутоантитела в дифференциальной диагностике отеков.

Результаты и обсуждение).

4.1. Разработка методов количественного определения С1 ингибитора.

4.1.1. Выделение и очистка С1 ингибитора человека.

4.1.2. Получение моноспецифической аптисыворотки к С1 ингибитору.

4.1.3. Выделение фракции IgG антител к С1 ингибитору.

4.1.4. Получение конъюгата пероксидазы с AT к С1 ингибитору человека.

4.1.5. Определение количества С1 ингибитора методом ИФА.

4.1.6. Определение концентрации С1 ингибитора методом радиальной иммунодиффузии (РИД) по Манчини.

4.2. Разработка методов определения функциональной активности С1 ингибитора.

4.2.1. Получение активированного первого субкомпонента компонента Cls.

4.2.2. Определение Cls в выделенном препарате.

4.2.3. Иммуноферментный метод определения функциональной активности С1 ингибитора.

4.3. Определение аутоантител к С1 ингибитору.

4.4. Дифференциальная диагностика отеков.

4.5. Взаимосвязь между функциональной активностью С1 ингибитора, ферментов Clrs и компонента СЗ в сыворотке крови пациентов, обусловленная наличием в крови циркулирующих иммунных комплексов.

4.6. Экспериментальная модель анафилактического действия комплемента

Выводы:.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «С1 ингибитор: функциональная активность, количество и аутоантитела в дифференциальной диагностике отеков»

Актуальность проблемы. Исследования, проводимые в группе молекулярной иммунологии, посвящены разработке современных методов определения функциональной активности компонентов и факторов комплемента человека и применению этих методов для клинических исследований различных заболеваний инфекционной и аутоиммунной природы. Данная работа является частью этих исследований и состоит из разработки им-муноферментных методов определения функциональной активности и количества С1 ингибитора системы комплемента человека, а также обнаружения аутоантител к С1 ингибитору для исследования механизмов функционирования системы комплемента in vivo и дифференциальной диагностики отеков.

С1 ингибитор является ключевым регулятором процессов активации комплемента, свертывающей и противосвертывающей, а также кинин-калликреиновой систем. Дефицит его (количественный и/или функциональный), врожденный или приобретенный (в результате образования аутоантител) приводит к возникновению отеков, часто опасных для жизни. Связаны ли отеки, наблюдаемые у больных, с наличием дефицитов С1 ингибитора или являются проявлением аллергии и других причин, а также установление характера дефицитов - определяет стратегию и тактику адекватной терапии.

До настоящего времени не было пакета современных единообразных методов, которые позволяли бы устанавливать наличие дефицита С1 ингибитора и характер этого дефицита.

Цель исследования

Экспериментально обосновать концепцию дифференциальной диагностики отеков, обусловленных врожденными и приобретенными дефицитами С1 ингибитора.

Задачи исследования

• разработать иммуноферментный метод определения количества С1 ингибитора в сыворотке крови;

• разработать иммуноферментные методы определения функциональной активности С1 ингибитора;

• разработать иммуноферментные методы обнаружения наличия IgG, IgA и IgM аутоантител к С1 ингибитору;

• экспериментально проверить применимость пакета методов для дифференциальной диагностики отеков на клиническом материале;

• предложить лабораторную животную модель комплемент-зависимого анафилактического шока.

Научная новизна результатов исследований.

• Создан пакет методов для дифференциальной диагностики отеков, обусловленных врожденными и приобретенными дефицитами С1 ингибитора, на основе современных единообразных ИФА тест-систем, содержащих ряд общих реагентов. Методы экспериментально апробированы в клинических исследованиях. Новизна метода определения функциональной активности С1 ингибитора подтверждена патентом.

• Впервые показана корреляция между функциональной активностью ферментов С Irs и содержанием С1 ингибитора в сыворотке крови пациентов.

• Предложена лабораторная животная модель комплемент-зависимого анафилактического шока, на которую получен патент.

Практическая значимость результатов исследований

Проведенные лабораторные исследования в ходе выполнения диссертационной работы разработанного пакета методов позволяют говорить о пригодности его для дифференциальной диагностики отеков, обусловленных врожденными и приобретенными дефицитами С1 ингибитора.

Положения, выносимые на защиту:

• Экспериментально обоснована концепция дифференциальной диагностики отеков, обусловленных врожденными и приобретенными дефицитами С1 ингибитора.

• Показана пригодность набора методов для дифференциальной диагностики отеков, обусловленных врожденными и приобретенными дефицитами С1 ингибитора.

• Существует взаимосвязь между содержанием С1 ингибитора, функциональной активностью ферментов Clrs и компонента СЗ в сыворотке крови пациентов, обусловленная наличием в крови циркулирующих иммунных комплексов.

• Лабораторная животная модель, основанная на гибели мышей при внутривенном введении сыворотки крови норки, отражает анафилактический шок, обусловленный активацией комплемента.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены и обсуждены на V симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, апрель 2002), на международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней -- прогресс и проблемы» (Санкт-Петербург, сентябрь 2003).

Публикации. Материалы по теме диссертации представлены в 7 публикациях.

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Андина, Светлана Семеновна

Выводы:

1. Разработан иммуноферментный метод определения количества С1 ингибитора в сыворотке крови с использованием моноспецифичных поликлональ-ных кроличьих антител к С1 ингибитору человека.

2. Разработаны иммуноферментные методы определения функциональной активности С1 ингибитора с использованием в качестве акцептора ингибитора различных сериновых протеиназ (получен патент РФ).

3. Разработаны иммуноферментные методы обнаружения наличия IgG, IgA и IgM аутоантител к С1 ингибитору путем определения количества иммунных комплексов, содержащих С1 ингибитор.

4. Пригодность разработанных методов показана путем проведения дифференциальной диагностики отеков у больных с врожденными количественными и/или функциональными дефицитами С1 ингибитора, аутоантителами к ингибитору или страдающими аллергией.

5. Показана взаимосвязь между функциональной активностью С1 ингибитора, ферментов С Irs и компонента СЗ в сыворотке крови пациентов, обусловленная наличием в крови циркулирующих иммунных комплексов.

6. Создана лабораторная модель комплемент-зависимого анафилактического шока, основанная на гибели мышей при внутривенном введении сыворотки крови норки.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Андина, Светлана Семеновна, 2006 год

1. Андросов В.Н., Порошин Ю.А. и др. Наследственный ангионевротический отек (классификация, диагностика, лечение, профилактика). //Методические рекомендации, Москва, 1987.

2. Белкин З.П. Феномен гибели мышей после парентерального введения сыворотки крови норки //Бюл. эксперим. биол. и мед. 1994. № 9. С. 290-291.

3. Вавилова JI.M., Голосова Т.Н. Система комплемента. Механизмы активации и регуляции, значение в биологии и медицине.// Итоги науки и техники. Иммунология, Москва, 1990, т.24, с.73-91.

4. Егорова А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика ИФА. Учебное пособие. М.: Высшая школа, 1991.С.182-183.

5. Иммунологическая недостаточность.// ВОЗ, Серия технических докладов 630, Женева, 1980

6. Иммунологические методы./ Под редакцией Г.Фриммеля, перевод с нем. Тарасова А.П.- Москва: Медицина. 1987. - С. 112-117.

7. Козлов JI.B. Особенности функционирования протеиназ комплемента.// Биоорганическая химия, т.20, №3, С. 229—241.

8. Козлов Л.В., Соляков Л.С.Возможность участия зимогенных форм факторов В и D в активации альтернативного пути системы комплемента человека./ТБиоорган. химия, 1982, №8, С. 342-348.

9. Козлов Л.В., Крылова Ю.И., Чих В.И., Молчанова Н.Н. Модифицированные методы определения функциональной активности факторов комплемента С2, СЗ, С4 и С5//Биоорган, химия. 1982. Т. 8. № 5. С. 652-659.

10. Козлов Л.В., Чих В.П., Соляков Л.С. Функциональная специфичность мембранос-вязанной СЗ/С5-конвертазы альтернативного пути активации комплемента человека// Биоорган, химия. 1982. Т. 8. № 6. С. 817-821.