Продукция растворимого Р-селектина тромбоцитами и эндотелиальными клетками тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Семенов, Артур Викторович

• Семенов, Артур Викторович
• кандидат биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Семенов, Артур Викторович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Р-селектин в реакциях тромбоцитов и ЭК.

2.1.1. Р-селектин представитель молекул клеточной адгезии семейства селектинов.

2.1.2. Локализация и функции Р-селектина.

2.1.2.1. Р-селектин тромбоцитов.

2.1.2.2. Р-селектин ЭК.

2.1.2.3. Структура и локализация лигандов Р-селектина.

2.1.2.4. Функции взаимодействия Р-селектин—PSGL-1.

2.2. Растворимые молекулы клеточной адгезии.

2.2.1. Механизмы образования и возможные функции.

2.2.2. Определение растворимых молекул клеточной адгезии при сердечно-сосудистых заболеваниях.

2.2.2.1. Семейство селектинов.

2.2.2.2. Суперсемейство иммуноглобулинов.

3.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Реактивы.

3.2. Методы исследования.

3.2.1. Тромбоциты.

3.2.1.1. Выделение тромбоцитов.

3.2.1.2. Получение обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП).

3.2.1.3. Получение отмытых тромбоцитов.

3.2.2. Эндотелиальные клетки сосудов человека.

3.2.2.1. Выделение эндотелиальных клеток.

3.2.2.2. Идентификация и культивирование эндотелиальных клеток.

3.2.3. Выделение мембранного Р-селектина.

3.2.4. Получение и отбор моноклональных антител.

3.2.4.1. Иммунизация.

3.2.4.2. Гибридизация и клонирование.

3.2.4.3. Скрининг моноклональных антител.

3.2.4.4. Получение препаративных количеств моноклональных антител.

3.2.4.5. Определение изотипов моноклональных антител.

-I л с

3.2.4.6. Коньюгация моноклональных антител с I и биотином.

3.2.5. Электрофорез и иммуноблоттинг.

3.2.6. Иммуноферментный метод определения Р-селектина.

3.2.6.1. Подбор моноклональных антител для иммуноферментного анализа.

3.2.6.2. Определение содержания Р-селектина.

3.2.6.3. Подготовка образцов для ИФА.

3.2.6.4. Получение и обработка плазмы крови для определения Р-селектина.

3.2.7. Секреция Р-селектина тромбоцитами и эндотелиальными клетками.

3.2.8. Лигандспецифическое взаимодействие Р-селектина in vitro.

3.2.9. Связывание поликлональных антител анти-766-776 с Р-селектином.

3.2.10. Определение маркеров активации тромбоцитов и эндотелиальных клеток.

3.2.11. Больные.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4.1. Содержание мембранного и растворимого Р-селектина в тромбоцитах.

4.2. Содержание мембранного и растворимого Р-селектина в эндотелиальных клетках.

4.3. Характеристика растворимого Р-селектина.

4.3.1. Определение цитоплазматического домена.

4.3.2. Определение рецепторной активности Р-селектина in vitro.

4.4. Растворимый Р-селектин в плазме крови здоровых доноров и больных.

4.4.1. Зависимость содержания Р-селектина в плазме крови от количества тромбоцитов.

4.4.2. Содержание Р-селектина в плазме крови больных с тромботичес-кими осложнениями.

4.4.2.1. Острый инфаркт миокарда.

4.4.2.2. Распространенный атеросклероз периферических сосудов

4.4.2.3. Первичная лёгочная гипертензия.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5.1. Тромбоциты и ЭК как источник растворимого Р-селектина в плазме крови.

5.1.1. Секреция растворимого Р-селектина тромбоцитами и ЭК.

5.1.2. Зависимость уровня плазменного Р-селектина от количества тромбоцитов.

5.1.3. Исследование корреляции между плазменным Р-селектином и маркерами активации тромбоцитов и активации/повреждения ЭК.

5.2. Структура и функциональные свойства растворимой формы Р-селектина.

5.3. Целесообразность определения Р-селектина в плазме больных с сердечно-сосудистыми патологиями.

5.3.1. Плазменный Р-селектин как маркер активации тромбоцитов.

5.3.2. Плазменный Р-селектин как прогностический фактор.

6. ВЫВОДЫ.ЮО

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Продукция растворимого Р-селектина тромбоцитами и эндотелиальными клетками»

Взаимодействие клеток друг с другом, а также с компонентами плазмы и соединительнотканного матрикса опосредуется мембранными белками-рецепторами, получившими название молекул клеточной адгезии (МКА). В число представителей МКА входит семейство селектинов.

Селектины играют ключевую роль в развитии воспалительной реакции, так как обеспечивают начальные стадии процесса адгезии лейкоцитов к эндотелию сосудов в местах воспаления. Р-селектин перераспределяется, вследствие экзоцитоза гранул, на поверхность тромбоцитов и эндотелиальных клеток (ЭК) после их активации и взаимодействуя со своим контррецептором на поверхности нейтрофилов и моноцитов опосредует первый этап адгезии: замедление движения и ролинг (rolling) лейкоцитов по поверхности ЭК и адгезированных тромбоцитов. Р-селектин также участвует в передаче активирующего сигнала внутрь лейкоцитов, что приводит к активации на их поверхности (32-интегринов. Активация (Зг-интегринов приводит к стабилизации лейкоцитов на поверхности эндотелия, необходимой для последующей трансмиграции лейкоцитов в зоны воспаления [Springer, 1995].

Наряду с мембранной формой существует растворимая форма Р-селектина, в норме присутствующая в плазме крови. В тромбоцитах и ЭК обнаружена специальная мРНК Р-селектина, в составе которой нет экзона, кодирующего трансмембранный домен, но присутствуют экзоны цитоплазматического участка [Johnson et al., 1989; 1990]. Повышенное содержание Р-селектина в плазме крови было выявлено при различных сердечно-сосудистых и воспалительных патологиях, сопряженных с активацией тромбоцитов и активацией и/или повреждением ЭК. Возможно растворимый Р-селектин может быть прогностическим фактором при некоторых заболеваниях [Blann et al., 1997с; Tsakiris et al., 1999]. Несмотря на большое количество работ, посвященных измерению Р-селектина в плазме, по-прежнему остаются неясным какие клетки, тромбоциты или ЭК, являются источником растворимого Р-селектина в норме и при различных патологических состояниях. Также остается не ясным каким образом может происходить секреция растворимого Р-селектина из тромбоцитов и ЭК, неизвестно каким может быть уровень этой секреции и остаются малоизученными свойства растворимой формы Р-селектина.

Целью настоящей работы было изучение продукции растворимого Р-селектина тромбоцитами и ЭК.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить панель моноАТ против Р-селектина и разработать иммуноферментный метод определения этого гликопротеида.

2. Определить содержание растворимого Р-селектина в тромбоцитах и исследовать влияние активации тромбоцитов различными агонистами на секрецию растворимого Р-селектина.

3. Определить количественное отношение между мембранной и растворимой формами Р-селектина в культивируемых ЭК разных типов сосудов. Оценить возможность секреции Р-селектина ЭК.

4. Определить уровень растворимого Р-селектина в плазме крови у здоровых доноров и у больных с некоторыми сердечно-сосудистыми патологиями. Оценить вклад тромбоцитов и ЭК в продукцию плазменного Р-селектина в норме и при патологиях, связанных с активацией тромбоцитов и повреждением ЭК.

5. Определить наличие цитоплазматического домена и оценить функциональную активность растворимой формы Р-селектина.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Семенов, Артур Викторович

6. выводы

1. Получена панель моноАТ против Р-селектина человека, на основе которых разработан метод иммуноферментного анализа для определения содержания Р-селектина

2. Тромбоциты содержат растворимый Р-селектин (-10% от общего Р-селектина тромбоцитов) и способны секретировать его при активации такими агонистами как тромбин, коллаген, АДФ и тромбоксан А2. При активации секретируется до 50% растворимого Р-селектина тромбоцитов.

3. Культивируемые ЭК пупочной вены и аорты человека содержат растворимый Р-селектин (~10-15% от общего Р-селектина ЭК). Количество общего и растворимого Р-селектина в ЭК аорты выше (в -2,5 раза), чем в ЭК пупочной вены. Растворимый Р-селектин обнаружен также в среде культивирования ЭК.

4. По крайней мере часть растворимого Р-селектина тромбоцитов, ЭК и плазмы крови содержит цитоплазматический домен, т. е. не является продуктом протеолитического отщепления внеклеточного участка мембранного Р-селектина.

5. Показано, что растворимый Р-селектин, секретированный из тромбоцитов, обладает рецепторной активностью схожей с активностью мембранной формы Р-селектина.

6. Анализ корреляции между концентрацией Р-селектина в плазме и содержанием тромбоцитов у здоровых доноров и больных со сниженной и повышенной продукцией тромбоцитов показывает, что тромбоциты являются основным источником Р-селектина плазмы. Однако ЭК также, по-видимому вносят свой вклад в продукцию растворимого Р-селектина, который может составлять до 1/3 от общего пула в плазме.

7. Установлено, что плазменный Р-селектин повышается при инфаркте миокарда, распространенном атеросклерозе и первичной легочной гипертензии. Содержание растворимого Р-селектина в плазме крови у больных с РА и ПЛГ коррелирует с содержанием маркеров активации тромбоцитов и не коррелирует с маркерами активации ЭК, это указывает на то, что источником повышенного уровня растворимого Р-селектина являются тромбоциты, а не ЭК.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Семенов, Артур Викторович, 2001 год

1. Антонов А.С., Крушинский А.В., Николаева М.А., Флегель Х.-Г. (1981) Первичная культура эндотелиальных клеток из пупочной вены человека: идентификация и характеристика растущей и конфлуентной культуры // Цитология.-.- Т. XXIII.- С. 1154-1159.

2. Мартынюк Т.В., Чазова И.Е., Масенко В.П., Беленков Ю.Н. // Кардиология. 1997. - Т. 37. -С. 25-29.

3. Комаров А.Л. (2001) Взаимосвязь тромботических осложнений с показателями гемостаза у больных с атеросклеротическим поражением артерий нижних конечностей по данным проспективного наблюдения. Тромбоз, гемостаз и реология, 1(5), 21-27.

4. Abe К., Arai Т., Mori М., Kida Н., Goya S., Matsuoka Н., Osaki Т., Tachibana I., Hayashi S. (1999) Effects of in vivo soluble selectin gene introduction of lps-induced leukocyte accumulation in the murine lung. Inflammation, 23(6), 523-534.

5. Aigner S., Ramos C.L., Hafezi-Moghadam A., Lawrence M.B., Friederichs J., Altevogt P., Ley K. (1998) CD24 mediates rolling of breast carcinoma cells on P-selectin. FASEB J., 12(12), 1241-1251.

6. Aigner S., Sthoeger Z.M., Fogel M., Weber E., Zarn J., Ruppert M., Zeller Y., Vestweber D., Stahel R., Sammar M., Altevogt P. (1997) CD24, a mucin-type glycoprotein, is a ligand for P-selectin on human tumor cells. Blood, 89(9), 3385-3395.

7. Andre P., Hartwell D., Hrachovinova I., Saffaripour S., Wagner D.D. (2000) Pro-coagulant state resulting from high levels of soluble P-selectin in blood. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(25), 13835-13840.

8. Asa D., Raycroft L., Ma L., Aeed P.A., Kaytes P.S., Elhammer A.P., Geng J.G. (1995) The P-selectin glycoprotein ligand functions as a common human leukocyte ligand for P- and E-selectins. J. Biol. Chem., 270(19), 1166211670.

9. Barkalow F.J., Barkalow K.L., Mayadas T.N. (2000) Dimerization of P-selectin in platelets and endothelial cells. Blood, 96(9), 3070-3077

10. Barkalow F.J., Barkalow K.L., Mayadas T.N. (2000) Dimerization of P-selectin in platelets and endothelial cells. Blood, 96(9), 3070-3077.

11. Berger G., Hartwell D.W., Wagner D.D. (1998) P-Selectin and platelet clearance. Blood, 92(11), 4446-4452.

12. Bertozzi C.R., Fukuda S., Rosen S.D. (1995) Sulfated disaccharide inhibitors of L-selectin: deriving structural leads from a physiological selectin ligand. Biochemistry, 34(44), 14271-14278.

13. Bevilacqua M., Butcher E., Furie В., et al. (1991) Selectins: a family of adhesion receptors. Cell, 67, 233.

14. Bevilacqua M., Nelson R.M. (1993) Selectins. J. Clin. Invest., 91, 379-387.

15. Bevilacqua M.P., Pober J.S., Mendrick D.L., Cotran R.S., Gimbrone M.A. Jr. (1987) Identification of an inducible endothelial-leukocyte adhesion molecule. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84(24), 9238-9242.

16. Bevilacqua M.P., Stengelin S., Gimbrone M.A. Jr, Seed B. (1989) Endothelial leukocyte adhesion molecule 1: an inducible receptor for neutrophils related to complement regulatory proteins and lectins. Science, 243(4895), 11601165.

17. Blanks J.E., Moll Т., Eytner R., Vestweber D. (1998) Stimulation of P-selectin glycoprotein ligand-1 on mouse neutrophils activates beta 2-integrin mediated cell attachment to ICAM-1. Eur. J. Immunol., 28(2), 433-443.

18. Blann A.D. & Lip G.Y. (1997a) Hypothesis: is soluble P-selectin a new marker of platelet activation? Atherosclerosis, 128(2), 135-138.

19. Blann A.D. & Lip G.Y. (2000) Cell adhesion molecules in cardiovascular disease and its risk factors-what can soluble levels tell us? J. Clin. Endocrinol. Metab., 85(5), 1748-51.

20. Blann A.D. and Lip G. Y., (2000) Cell adhesion molecules in cardiovascular disease and its risk factors—what can soluble levels tell us? J. Clin. Endocrinol. Metab. 85(5), 1748-51

21. Blann A.D., Amiral J., McCollum C.N. (1996a) Circulating endothelial cell/leucocyte adhesion molecules in ischaemic heart disease. Br. J. Haematol., 95(2), 263-265.

22. Blann A.D., Amiral J., McCollum C.N. (1997b) Prognostic value of increased soluble thrombomodulin and increased soluble E-selectin in ischaemic heart disease. Eur. J. Haematol., 59(2), 115-120.

23. Blann A.D., Dobrotova M., Kubisz P., McCollum C.N. (1995) Von Willebrand factor, soluble P-selectin, tissue plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor in atherosclerosis. Thromb. Haemost., 74(2), 626-630.

24. Blann A.D., Faragher E.B., McCollum C.N. (1997c) Increased soluble P-selectin following myocardial infarction: a new marker for the progression of atherosclerosis. Blood Coagul. Fibrinolysis, 8(7), 383-390.

25. Blann A.D., Lip G.Y., Beevers D.G., McCollum C.N. (1997d) Soluble P-selectin in atherosclerosis: a comparison with endothelial cell and platelet markers. Thromb. Haemost. V.77, 6 1077-80.

26. Blann A.D., McCollum C.N. (1994) Circulating endothelial cell/leukocyte adhesion molecules in atherosclerosis. Thromb. Haemost., 72(1), 151-154.

27. Blann A.D., McCollum C.N. (1998a) Increased soluble P-selectin in peripheral artery disease: a new marker for the progression of atherosclerosis. Thromb. Haemost., 80(6), 1031-1032.

28. Blann A.D., Miller J.P., McCollum C.N. (1997e) Von Willebrand factor and soluble E-selectin in the prediction of cardiovascular disease progression in hyperlipidaemia. Atherosclerosis, 132(2), 151-156.

29. Blann A.D., Sanders P.A., Herrick A., Jayson M.I. (1996b) Soluble L-selectin in the connective tissue diseases. Br. J. Haematol., 95(1), 192-194.

30. Bonfanti R., Furie B.C., Furie В., Wagner D.D. (1989) PADGEM (GMP140) is a component of Weibel-Palade bodies of human endothelial cells. Blood, 73(5), 1109-1112.

31. Bowen B.R., Nguyen Т., Lasky L.A. (1989) Characterization of a human homologue of the murine peripheral lymph node homing receptor. J. Cell. Biol., 109(1), 421-427.

32. Brandley B.K., Swiedler S.J., Robbins P.W. (1990) Carbohydrate ligands of the LEC cell adhesion molecules. Cell, 63(5), 861-863.

33. Bruehl R.E., Moore K.L., Lorant D.E., Borregaard N., Zimmerman G.A., McEver R.P., Bainton D. F. (1997) Leukocyte activation induces surfaceredistribution of P-selectin glycoprotein ligand-1. J. Leukoc. Biol., 61(4), 489-499.

34. Butcher E.C. (1991) Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell 67, 1033-1036.

35. Caen J.P., Rosa J-P. (1995) Platelet-vessel wall interaction: from the bedside to molecules. Thromb. Haemost., 74, 18-24.

36. Camerini D., James S.P., Stamenkovic I., Seed B. (1989) Leu-8/TQl is the human equivalent of the Mel-14 lymph node homing receptor. Nature, 342(6245), 78-82.

37. Carlos T.M., Harlan J.M. (1994) Leukocyte-endothelial adhesion molecules. Blood, 84,2068-2101.

38. Celi A., Lorenzet R, Furie В., Furie B.C. (1997) Platelet-leukocyte-endothelial cell interaction on the blood vessel wall. Semin. Hematol., 34(4), 327-335

39. Celi A., Pellegrini G., Lorenzet R., De Blasi A., Ready N., Furie B.C., Furie

40. B. (1994) P-selectin induces the expression of tissue factor on monocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(19), 8767-8771.

41. Cerletti C., Evangelista V., de Gaetano G. (1999) P-selectin-beta 2-integrin cross-talk: a molecular mechanism for polymorphonuclear leukocyte recruitment at the site of vascular damage. Thromb. Haemost., 82(2), 787793.

42. Chong B.H., Murray В., Berndt M.C., Dunlop L.C., Brington Т., Chesterman

43. C.N. (1994) Plasma P-selectin is increased in thrombotic consumptive platelet disorders. Blood, 83, 1535-1541.

44. Christenson R.H. & Azzazy H.M. (1998) Biochemical markers of the acute coronary syndromes. Clin. Chem., 44(8 Pt 2), 1855-1864.

45. Christman B.W., McPherson C.D., Newman J.H., King G.A., Bernard G.R., Groves B.M., Loyd J.E. (1992) An imbalance between the excretion of thromboxane and prostacyclin metabolites in pulmonary hypertension. N. Engl. J. Med., 327(2), 70-75.

46. Clemetson K.J. (1995) Platelet activation: signal transduction via membrane receptors. Thromb. Haemost., 74, 111-116.

47. Cooper D., Butcher C.M., Berndt M.C., Vadas M.A. (1994) P-selectin interacts with a beta 2-integrin to enhance phagocytosis. J. Immunol., 153(7), 3199-3209.

48. Crovello C.S., Furie B.C., Furie B. (1993) Rapid phosphorylation and selective dephosphorylation of P-selectin accompanies platelet activation. J. Biol. Chem., 268(20), 14590-14593.

49. Crovello C.S., Furie B.C., Furie B. (1995) Histidine phosphorylation of P-selectin upon stimulation of human platelets: a novel pathway for activation-dependent signal transduction. Cell, 82(2), 279-286.

50. Cummings R.D., Smith D.F. (1992) The selectin family of carbohydrate-binding proteins: structure and importance of carbohydrate ligands for cell adhesion. Bioessays, 14(12), 849-856.

51. Davi G., Romano M., Mezzetti A., Procopio A., Iacobelli S., Antidormi Т., Bucciarelli Т., Alessandrini P., Cuccurullo F., Bittolo Bon G. (1998) Increased levels of soluble P-selectin in hypercholesterolemic patients. Circulation, 97 (10), 953-957.

52. De Caterina R., Basta G., Lazzerini G., Dell'Omo G., Petrucci R., Morale M., Carmassi F., Pedrinelli. (1997) Soluble vascular cell adhesion molecule-1 as a biohumoral correlate of atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol., 17(11), 2646-2654.

53. Diacovo T.G., Roth S.J., Morita C.T., Rosat J.P., Brenner M.B., Springer T.A. (1996) Interactions of human alpha/beta and gamma/delta T lymphocyte subsets in shear flow with E-selectin and P-selectin. J. Exp. Med., 183(3), 1193-1203.

54. Dunlop L.C., Skinner M.P., Bendall L.J., Favaloro E.J., Castaldi P.A., Gorman J.J., Gamble J.R., Vadas M.A. and Berndt M.C. (1992) Characterisation of GMP-140 (P-selectin) as a circulating plasma protein. J. Exp. Med., 175,1147-1150

55. Epperson Т.К., Patel K.D., McEver R.P., Cummings RD. (2000) Noncovalent association of P-selectin glycoprotein ligand-1 and minimal determinants for binding to P-selectin. J. Biol. Chem., 275(11), 7839-7853.

56. Fijnheer R., Frijns C.J., Korteweg J., Rommes H., Peters J.H., Sixma J.J., Nieuwenhuis H.K. (1997) The origin of P-selectin as a circulating plasma protein. Thromb. Haemost., 77(6), 1081-1085.

57. Fraker PJ, Speck JC Jr. (1978) Protein and cell membrane iodinations with a sparingly soluble chloroamide, l,3,4,6-tetrachloro-3a,6a-diphrenylglycoluril. Biochem Biophys. Res. Commun., 80(4), 849-57.

58. Frijns C.J., Kappelle L.J., van Gijn J., Nieuwenhuis H.K., Sixma J.J., Fijnheer R. (1997) Soluble adhesion molecules reflect endothelial cell activation in ischemic stroke and in carotid atherosclerosis. Stroke, 28(11), 2214-2218.

59. Fujimoto Т., McEver R.P. (1993) The cytoplasmic domain of P-selectin is phosphorylated on serine and threonine residues. Blood, 82(6), 1758-1766.

60. Fujimoto T.T., Noda M., Takafuta Т., Shimomura Т., Fujimura K., Kuramoto A. (1996) Expression and functional characterization of the P-selectin glycoprotein ligand-1 in various cells. Int. J. Hematol., 64(3-4), 231-239.

61. Gabbasov Z.A., Popov E.G., Gavrilov I.Yu., Pozin E.Ya. (1989) Platelet aggregation: the use of optical density fluctuations to study microaggregate formation in platelet suspension. Thromb. Res., 54,215-223.

62. Gamble J.R., Skinner M.P., Berndt M.C., Vadas M.A. (1990) Prevention of activated neutrophil adhesion to endothelium by soluble adhesion protein GMP140. Science, 249(4967), 414-417.

63. Geng J.G., Heavner G.A., McEver R.P. (1992) Lectin domain peptides from selectins interact with both cell surface ligands and Ca2+ ions. J. Biol. Chem., 267(28), 19846-19853.

64. Geng J.G., Moore K.L., Johnson A.E., McEver R.P. (1991) Neutrophil recognition requires a Ca(2+)-induced conformational change in the lectin domain of GMP-140. J. Biol. Chem., 266(33), 22313-22318.

65. Gimbrone M.A. Jr. (1976) Culture of vascular endothelium. Prog. Hemost., Thromb., 3, 1-28.

66. Goetz D.J., Greif D.M., Ding H., Camphausen R.T., Howes S., Comess K.M., Snapp K.R., Kansas G.S., Luscinskas F.W. (1997) Isolated P-selectin glycoprotein ligand-1 dynamic adhesion to P- and E-selectin. J. Cell. Biol., 137(2), 509-519.

67. Guyer D.A., Moore K.L., Lynam E.B., Schammel C.M., Rogelj S., McEver R.P., Sklar L.A. (1996) P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) is a ligand for L-selectin in neutrophil aggregation. Blood, 88(7), 2415-2421.

68. Haller H., Kunzendorf U., Sacherer K., Lindschau C., Walz G., Distler A., Luft F.C. (1997) T-cell adhesion to P-selectin induces tyrosine phosphorylation of ppl25 focal adhesion kinase and other substrates. J. Immunol., 158(3), 1061-1067.

69. Handa K., Nudelman E.D., Stroud M.R., Shiozawa Т., Hakomori S. (1991) Selectin GMP-140 (CD62; PADGEM) binds to sialosyl-Le(a) and sialosyl-Le(x), and sulfated glycans modulate this binding. Biochem. Biophys. Res. Commun., 181(3), 1223-1230.

70. Hayward R, Campbell В., Shin Y.K., Scalia R, Lefer A.M. (1999) Recombinant soluble P-selectin ligand-1 protects against myocardial ischemic reperfusion incats. Cardiovasc. Res., 41, 65-76.

71. Hidari K.I., Weyrich A.S., Zimmerman G.A., McEver R.P. (1997) Engagement of P-selectin glycoprotein ligand-1 enhances tyrosine phosphorylation and activates mitogen-activated protein kinases in human neutrophils. J Biol Chem 272(45), 28750-28756.

72. Holmsen H. (1994) Significance of testing platelet functions in vitro. Eur. J. Clin. Invest., 24 (suppl. 1), 3-8.

73. Jilma В., Eichler H.G., Vondrovec В., Breiteneder H., Kyrle P.A., Kitzweger E., Kapiotis S., Speiser W. (1996b) Effects of desmopressin on circulating P-selectin. Br. J. Haematol., 93(2), 432-436.

74. Jilma В., Fasching P., Ruthner C., Rumplmayr A., Ruzicka S., Kapiotis S., Wagner O.F., Eichler H.G. (1996c) Elevated circulating P-selectin in insulin dependent diabetes mellitus. Thromb. Haemost., 76(3), 328-332.ill

75. Jilma В., Hildebrandt J., Kapiotis S., Wagner O.F., Kitzweger E., Mullner C., Monitzer В., Krejcy K., Eichler H.G. (1996a) Effects of estradiol on circulating P-selectin. J. Clin. Endocrinol. Metab., 81(6), 2350-2355.

76. Johnston G.I., Bliss G.A., Newman PJ. and McEver R.P. (1990) Structure of the human gene encoding granule membrane protein-140, a member of the selectin family of adhesion receptors for leukocytes. J. Biol. Chem., 265, 21381-21385.

77. Johnston G.I., Cook R.G. and McEver R.P. (1989) Cloning of GMP-140, a granule membrane protein of platelets and endothelium: sequence similarity to proteins involved in cell adhesion and inflammation. Cell, 56,1033-1044.

78. Jutila M.A., Kishimoto Т.К., Butcher E.C. (1990) Regulation and lectin activity of the human neutrophil peripheral lymph node homing receptor. Blood, 76(1), 178-183.

79. Jutila M.A., Rott L., Berg E.L., Butcher E.C. (1989) Function and regulation of the neutrophil MEL-14 antigen in vivo: comparison with LFA-1 and MAC-1. J. Immunol., 143(10), 3318-3324.

80. Jutila M.A., Watts G., Walcheck В., Kansas G.S. (1992) Characterization of a functionally important and evolutionarily well-conserved epitope mapped to the short consensus repeats of E-selectin and L-selectin. J. Exp. Med., 175(6), 1565-1573.

81. Kahn J., Ingraham R.H., Shirley F., Migaki G.I., Kishimoto Т.К. (1994) Membrane proximal cleavage of L-selectin: identification of the cleavage site and a 6-kD transmembrane peptide fragment of L-selectin. J. Cell Biol., 125(2), 461-470.

82. Kaikita K., Ogawa H., Yasue H., Sakamoto Т., Suefuji H., Sumida H., Okumura K. (1995) Soluble P-selectin is released into the coronary circulation after coronary spasm. Circulation, 92(7), 1726-1730.

83. Kameda H., Morita I., Handa M., Kaburaki J., Yoshida Т., Mimori Т., Murota S., Ikeda Y. (1997) Re-expression of functional P-selectin molecules on the endothelial cell surface by repeated stimulation with thrombin. Br. J. Haematol., 97(2), 348-355.

84. Kansas G.S. (1996) Selectins and their ligands: current concepts and controversies. Blood, 88(9), 3259-3287.

85. Kawabata К., Nagake Y., Shikata K., Fukuda S., Nakazono H., Takahashi M., Ichikawa H., Makino H. (1998) Soluble P-selectin is released from activated platelets in vivo during hemodialysis. Nephron, 78(2), 148-155.

86. Kohler G. and Milstein C. (1975) Countinious cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature, 256, 495-497.

87. Konstantopoulos K., Mclntire L.V. (1997) Effects of fluid dynamic forces on vascular cell adhesion. J. Clin. Invest., 100(1 lSuppl), S19-S23.

88. Kuzu I., Bicknell R., Fletcher C., Gatter K.C. (1993) Expression of adhesion molecules on the endothelium of normal tissue vessels and vascular tumours. Lab. Invest., 69, 322-328.

89. Marlin S.D., Springer T.A. (1987) Purified intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is a ligand for lymphocyte function-associated antigen 1 (LFA-1). Cell, 51(5), 813-819.

90. May G.L., Dunlop L.C., Sztelma K., Berndt M.C., Sorrell T.C. (1992) GMP-140 (P-selectin) inhibits human neutrophil activation by lipopolysaccharide: analysis by proton magnetic resonance spectroscopy. Biochem. Biophys. Res. Commun., 183(3), 1062-1069.

91. Mayadas T.N., Johnson R.C., Rayburn H., Hynes R.O., Wagner D.D. (1993) Leukocyte rolling and extravasation are severely compromised in P selectin-deficient mice. Cell, 74(3), 541-554.

92. McEver R. and Cummings R. (1997) Role of PSGL-1 Binding to Selectins in Leukocyte Recruitment. J. Clin. Invest., Volume 100, Number 3, 485-492.

93. McEver R.P. (1991) Selectins: novel receptors that mediate leukocyte adhesion during inflammation. Thromb. Haemost., 65(3), 223-228.

94. McEver R.P., Beckstead J.H., Moore K.L., Marshall-Carlson L., Bainton D.F. (1989) GMP-140, a platelet alpha-granule membrane protein is also synthesized by vascular endothelial cells and is localized in Weibel-Palade bodies. J. Clin. Invest., 84, 92-99.

95. McEver R.P., Cummings R.D. (1997) Role of PSGL-1 binding to selectins in leukocyte recruitment. J. Clin. Invest., 100(11 Suppl), S97-S103.

96. McEver R.P., Martin M.N. (1984) A monoclonal antibody to a membrane glycoprotein binds only to activated platelets. J. Biol. Chem., 259(15), 97999804.

97. McGill S., Ahmed N.A., Christou N.V. (1998) Endothelial Cells: Role in Infection and Inflammation. World J. Surg., 22, 171-178,.

98. Mehta P., Patel K.D., Laue T.M., Erickson H.P., McEver R.P. (1997) Soluble monomeric P-selectin containing only the lectin and epidermal growth factor domains binds to P-selectin glycoprotein ligand-1 on leukocytes. Blood, 90(6), 2381-2389.

99. Miwa K., Igawa A., Inoue H. (1997) Soluble E-selectin, ICAM-1 and VCAM-1 levels in systemic and coronary circulation in patients with variant angina. Cardiovasc. Res. 36(1), 37-44.

100. Moore K.L. (1998) Structure and function of P-selectin glycoprotein ligand-1. Leuk. Lymphoma, 29(1-2), 1-15.

101. Moore K.L., Patel K.D., Bruehl R.E., Li F., Johnson D.A., Lichenstein H.S., Cummings R.D., Bainton D.F., McEver R.P. (1995) P-selectin glycoprotein ligand-1 mediates rolling of human neutrophils on P-selectin. J. Cell. Biol., 128(4), 661-671.

102. Moore K.L., Stults N.L., Diaz S., Smith D.F., Cummings R.D., Varki A., McEver R.P. (1992) Identification of a specific glycoprotein ligand for P-selectin (CD62) on myeloid

103. Morbidelli L., Brogelli L., Granger H.J., Ziche M. (1998) Endothelial cell migration is induced by soluble P-selectin. Life. Sci., 62(1), PL7-P11.

104. Muller W.A., Weigl S.A., Deng X., Phillips D.M. (1993) PECAM-1 is required for transendothelial migration of leukocytes. J. Exp. Med., 178(2), 449-460.

105. Munro J.M., Pober J.S., Cotran R.S. (1989) Tumor necrosis factor and interferon-gamma induce distinct patterns of endothelial activation and associated leukocyte accumulation in skin of Papio anubis. Am. J. Pathol., 135(1), 121-133.

106. Munro J.M., Pober J.S., Cotran R.S. (1991) Recruitment of neutrophils in the local endotoxin response: association with de novo endothelial expression of endothelial leukocyte adhesion molecule-1. Lab. Invest. 64(2), 295-299.

107. Norman K.E., Moore K.L., McEver R.P., Ley K. (1995) Leukocyte rolling in vivo is mediated by P-selectin glycoprotein ligand-1. Blood, 86(12), 44174421.

108. Palabrica Т., Lobb R., Furie B.C., Aronovitz M., Benjamin C., Hsu Y.M., Sajer S.A., Furie B. (1992) Leukocyte accumulation promoting fibrin deposition is mediated in vivo by P-selectin on adherent platelets. Nature, 359(6398), 848-851.

109. Parker C. 3rd, Vita J.A., Freedman J.E. (2001) Soluble adhesion molecules and unstable coronary artery disease. Atherosclerosis, 156 (2), 417-424.

110. Patcheke H. (1981) Shape and functional properties of human platelets washed with citrate. Haemostasis, 10, 14-27.

111. Patel K.D., Nollert M.U., McEver R.P. (1995) P-selectin must extend a sufficient length from the plasma membrane to mediate rolling of neutrophils. J. Cell. Biol., 131(6 Pt 2), 1893-1902.

112. Patel K.D., Zimmerman G.A., Prescott S.M., McEver R.P., Mclntyre T.M. (1991) Oxygen radicals induce human endothelial cells to express GMP-140 and bind neutrophils. J. Cell. Biol., 112(4), 749-759.

113. Pigott R., Dillon L.P., Hemingway I.H., Gearing A.J.H. (1992) Soluble forms of E-selectin, ICAM-1 and VCAM-1 are present in the supernatants of cytokine activated cultured endothelial cells. Bio-chem. Biophys. Res. Commun., 187, 584.

114. Rainger G.E., Buckley C., Simmons D.L., Nash G.B. (1997) Cross-talk between cell adhesion molecules regulates the migration velocity of neutrophils. Curr. Biol., 7(5), 316-325.

115. Ridker P.M., Hennekens C.H., Roitman-Johnson В., Stampfer M.J., Allen J. (1998) Plasma concentrations of soluble intercellular adhesion molecule-1 and risks of future myocardial infarction in apparently healthy men. Lancet, 351, 88-92.

116. Rothlein R, Mainolfi E.A., Czajkowski M., Marlin S.D. (1991) A form of circulating ICAM-1 in human serum. J. Immunol., 147(11), 3788-3793.

117. Sakamaki F., Kyotani S., Nagaya N., Sato N., Oya H., Satoh Т., Nakanishi N. (2000) Increased plasma P-selectin and decreased thrombomodulin in pulmonary arterial hypertension were improved by continuous prostacyclin therapy. Circulation, 103(5), 779.

118. Sako D., Chang X.J., Barone K.M., Vachino G., White H.M., Shaw G., Veldman G.M., Bean K.M., Ahern T.J., Furie В., et al. (1993) Expression cloning of a functional glycoprotein ligand for P-selectin. Cell, 75(6), 11791186.

119. Sako D., Comess K.M., Barone K.M., Camphausen R.T., Cumming D.A., Shaw G.D. (1995) A sulfated peptide segment at the amino terminus of PSGL-1 is critical for P-selectin binding. Cell, 83(2), 323-331.

120. Sakurai S., Inoue A., Koh C.S., Owa M., Yanagisawa N. (1997) Soluble form of selectins in blood of patients with acute myocardial infarction and coronary intervention. Vase. Med, 2(3), 163-168.

121. Schleiffenbaum В., Spertini O., Tedder TF. (1992) Soluble L-selectin is present in human plasma at high levels and retains functional activity. J. Cell Biol. 119(1), 229-238.

122. Serebruany V.L., Bahr R.D., O'Connor C.M., Lowry D.R., Gurbel P.A. (1998) Antecedent aspirin therapy inhibits baseline platelet activity in patients presenting with acute myocardial infarction. The GUSTO-III Platelet Substudy. Cardiology, 90(1), 37-42.

123. Serebruany V.L., Levine D.J., Nair G.V., Meister A.F., Gurbel P.A. (2001) Usefulness of combining necrosis and platelet markers in triaging patients presenting with chest pain to the emergency department. J. Thromb. Thrombolysis, 11(2), 155-162.

124. Siegelman M.H., Cheng I.C., Weissman I.L., Wakeland E.K. (1990) The mouse lymph node homing receptor is identical with the lymphocyte cell surface marker Ly-22: role of the EGF domain in endothelial binding. Cell, 61(4), 611-622.

125. Siegelman M.H., Weissman I.L. (1989) Human homologue of mouse lymph node homing receptor: evolutionary conservation at tandem cell interaction domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86(14), 5562-5566.

126. Skinner M.P., Fournier D.J., Andrews R.K., Gorman J.J., Chesterman C.N., Berndt M.C. (1989) Characterisation of human platelet GMP-140 as a heparin-binding protein. Biochem. Biophys. Res. Commun., 164:1373-1379.

127. Skinner M.P., Lucas C.M., Burns G.F., Chesterman C.N., Berndt M.C. (1991) GMP-140 binding to neutrophils is inhibited by sulfated glycans. J. Biol. Chem., 266(9), 5371-5374.

128. Snapp K.R., Craig R., Herron M., Nelson R.D., Stoolman L.M., Kansas G.S. (1998) Dimerization of P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) required for optimal recognition of P-selectin. J. Cell. Biol., 142(1), 263-270.

129. Spertini O., Cordey A.S., Monai N., Giuffre L., Schapira M. (1996) P-selectin glycoprotein ligand 1 is a ligand for L-selectin on neutrophils, monocytes, and CD34+ hematopoietic progenitor cells. J. Cell. Biol., 135(2), 523-531.

130. Spertini O., Freedman A.S., Belvin M.P., Penta A.C., Griffin J.D., Tedder T.F. (1991) Regulation of leukocyte adhesion molecule-1 (TQ1, Leu-8) expression and shedding by normal and malignant cells. Leukemia, 5(4), 300308.

131. Springer T.A. (1995) Traffic signals on endothelium for recirculation and leukocyte emigration. Annu. Rev. Physiol., 57, 827-872.

132. Subramaniam M., Koedam J.A., Wagner D.D. (1993) Divergent fates of P-and E-selectins after their expression on the plasma membrane. Mol. Biol. Cell., 4(8), 791-801.

133. Tanio J.W., Chandrasekar B.B., Albelda S.M., Eisen H.J. (1994) Differential ex-pression of the cell adhesion molecules ICAM-1, VCAM-1 and E-selectin in normal and post-transplantation myocardium. Circulation, 89, 1760-1768.

134. Tomoda H., Aoki N. (1998) Plasma soluble P-selectin in acute myocardial infarction: effects of coronary recanalization therapy. Angiology, 49(10), 807813.

135. Towbin H., Stachelin Т., Gordon J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 227, 680-685.

136. Tsukamoto K., Yokono K., Amano K., et al. (1995) Administration of monoclonal antibodies against vascular cell adhesion molecule-1/very late antigen-4 ab-rogates predisposing autoimmune diabetes in NOD mice. Cell Immunol., 165, 193-201.

137. Ushiyama S., Laue T.M., Moore K.L., Erickson H.P., McEver R.P. (1993) Structural and functional characterization of monomeric soluble P-selectin and comparison with membrane P-selectin. J. Biol. Chem., 268, 1522915237.

138. Varki A. (1995) Selectin ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(16), 73907397.

139. Verhaar M.C., Beutler J.J., Gaillard C.A., Koomans H.A., Fijnheer R., Rabelink T.J. (1998) Progressive vascular damage in hypertension is associated with increased levels of circulating P-selectin. J. Hypertens, 16(1), 45-50.

140. Vlasova E.V., Vorozhaikina M.M., Khral'tsova L.S., Tuzikov A.B., Popova I.S., Tsvetkov I.E., Nifant'ev N.E., Bovin N.V. (1996) Selectin receptors. 5

141. Monoclonal antibodies to the synthetic antigens SiaLe(a) and SiaLe(x). Bioorg. Khim., 22(5), 358-365.

142. Wagner D.D. (1993) The Weibel-Palade body: the storage granule for von Willebrand factor and P-selectin. Thromb. Haemost. 70(1), 105-110.

143. Watson S.R., Imai Y., Fennie C., Geoffrey J., Singer M., Rosen S.D., Lasky L.A. (1991) The complement binding-like domains of the murine homing receptor facilitate lectin activity. J. Cell. Biol., 115(1), 235-243.

144. Weiss H.J. (1995) Flow-related platelet deposition on subendothelium. Thromb. Haemost., 74, 117-122.

145. Weller A., Isenmann S., Vestweber D. (1992) Cloning of the mouse endothelial selectins. Expression of both E- and P-selectin is inducible by tumor necrosis factor alpha. J. Biol. Chem., 267(21), 15176-15183.

146. Weyrich A.S., Elstad M.R, McEver R.P., Mclntyre T.M., Moore K.L., Morrissey J.H., Prescott S.M., Zimmerman G.A. (1996) Activated platelets signal chemokine synthesis by human monocytes. J. Clin. Invest. 97(6), 15251534.

147. Wilkins P.P., McEver R.P., Cummings R.D. (1996) Structures of the O-glycans on P-selectin glycoprotein ligand-1 from HL-60 cells. J. Biol. Chem., 271(31), 18732-18742.

148. Wilkins P.P., Moore K.L., McEver R.P., Cummings R.D. (1995) Tyrosine sulfation of P-selectin glycoprotein ligand-1 is required for high affinity binding to P-selectin. J. Biol. Chem., 270(39), 22677-22680

149. Wong C.S., Gamble J.R., Skinner M.P., Lucas C.M., Berndt M.C., Vadas M.A. (1991) Adhesion protein GMP140 inhibits superoxide anion release by human neutrophils. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88(6), 2397-2401.

150. Woodcock S.A., Kyriakides C., Wang Y., Austen W.G. Jr, Moore F.D. Jr, Valeri R, Hartwell D., Hechtman H.B. (2000) Soluble P-selectin moderates complement dependent injury. Shock, 14(6), 610-615.

151. Zhang R.L., Chopp M., Jiang N., et al. (1995) Anti-intercellular adhesion mole-cule-1 antibody reduces ischaemic cell damage after transient but not perma-nent middle cerebral artery occlusion in the Wistar rat. Stroke, 26, 1438-1443.

152. Zhou Q., Moore K.L., Smith D.F., Varki A., McEver R.P., Cummings R.D. (1991) The selectin GMP-140 binds to sialylated, fiicosylated lactosaminoglycans on both myeloid and nonmyeloid cells. J. Cell Biol., 115(2), 557-564.

153. Zimmerman G.A., Elstad M.R., Lorant D.E., Mclntyre T.M., Prescott S.M., Topham M.K., Weyrich A.S., Whatley R.E. (1996) Platelet-activating factor (PAF), signalling and adhesion in cell-cell interactions. Adv. Exp. Med.Biol., 416, 297-304.