Методы сканирующей зондовой микроскопии для оценки физических маркеров раковых заболеваний тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, доктор наук Докукин Максим Евгеньевич

• Докукин Максим Евгеньевич
• доктор наук
• 2023

Оглавление диссертации доктор наук Докукин Максим Евгеньевич

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

Цель и задачи работы

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость работы

Методология и методы исследования

Основные положения, выносимые на защиту

Личный вклад автора

Апробация результатов диссертационной работы

Публикации автора

ГЛАВА 1. Методы количественной оценки модуля упругости клеток на основе данных силовых кривых, получаемых с помощью АСМ

Введение

Методы и материалы

Клеточные культуры эпителиальных клеток шейки матки человека

Клеточные культуры первичных фибробластов кожи морских свинок

Культура клеточной линии MCF-7

Методика удаления молекулярной части надклеточного слоя

Атомно-силовая микроскопия

Методика отбора данных силовых кривых для анализа

Модели для расчета модуля упругости клеток

Модель с учетом надклеточного слоя в случае простой геометрии клетки

Модель в случае слабо закреплённой сферической клетки

Модель для случая толстого надклеточного слоя

Анализ применимости моделей, применяемых для расчета модуля упругости клеток

Обсуждение результатов и выводы

ГЛАВА 2. Применение модуля упругости и параметров надклеточной структуры для выявления инициирующих раковых клеток

Введение

Определение различия биофизических параметров между покоящимися «спящими» стволовыми и пролиферирующими миелоидными клетками

Методы и материалы

Образцы CD34+ от пациентов с ХМЛ

Атомно-силовая микроскопия

Определение модуля упругости и параметров надклеточной структуры клеток CD34+ G0 и CD34+ G1 у больных ХМЛ

Оценка использования модуля упругости в качестве физического маркера для определения меланоцитов, инициирующих возникновение меланомы

Методы и материалы

Выделение клеток меланомы

Атомно-силовая микроскопия

Методика отбора силовых кривых

Расчет модуля упругости и параметров надклеточной структуры меланоцитов

Механические свойства меланоцитов, инициирующих возникновение меланомы в модельном организме рыбок данио-рерио

Обсуждение результатов и выводы

ГЛАВА 3. Фрактальная размерность АСМ-изображений в качестве физиомаркера для идентификации предраковых и раковых клеток

Введение

Методы и материалы

Клеточные культуры

Подготовка клеток к исследованию на атомно-силовом микроскопе

Атомно-силовая микроскопия

Электронная микроскопия

Расчет фрактальной размерности

Фрактальная размерность адгезионных карт поверхности эпителиальных клеток шейки матки человека при поэтапном развитии рака in vitro

Фрактальная размерность как потенциальный биофизический маркер раковых клеток

Возникновение мультифрактального поведения на адгезионных картах поверхности клеток

Стабильность параметра мультифрактальности для различных условий сканирования

Максимальная сила сканирования

Зависимости от радиуса зонда АСМ

Влияние загрязнения зонда АСМ на параметры карт адгезии

Стабильность мультифрактальности в зависимости от цифрового разрешения изображения

Размер элементов разрешаемых с помощью адгезионных изображений

Капиллярные силы

Использование мультифрактальности адгезионных карт в качестве физиомаркера для определения предраковых и раковых эпителиальных клеток шейки матки человека

Причины биологических и физических изменений поверхности клеток

Обсуждение результатов и выводы

ГЛАВА 4. Методика визуализации адгезионных и вязкоупругих характеристик поверхности биологических и полимерных материалов на базе субрезонансного режима сканирования атомно-силового микроскопа

Введение

Методы и материалы

Атомно-силовая микроскопия

Фиксация и подготовка клеток A375

Подготовка образцов корнеоцитов

Получение изображений с помощью методики Ringing mode

Сбор и обработка сигналов АСМ в методике Ringing mode

Методика визуализации адгезионных и вязкоупругих характеристик образцов

Субрезонансные режимы сканирования в АСМ

Восстановленная адгезия

Потеря энергии при отрыве зонда АСМ от поверхности образца

Визуализация высоты образца в момент отрыва зонда АСМ от поверхности - адгезионная высота

Визуализация карт адгезионной деформации и расстояния отрыва

Сравнение адгезии, измеряемой в субрезонансных методах и восстановленной адгезии

Связь адгезии с данными адгезионной деформации и расстоянием отрыва

Сравнение получаемого разрешения для карт адгезионной и обычной высоты

Вклад капиллярного взаимодействия в потери энергии при отрыве зонда АСМ от поверхности образца при сканировании на воздухе

Обсуждение результатов и выводы

ГЛАВА 5. Анализ комплексных изображений поверхности клеток для неинвазивного диагностирования рака мочевого пузыря человека и классификации онкологической агрессивности раковых клеток

Введение

Методы и материалы

Получение образцов мочи

Подготовка клеток, полученных из мочи для исследования методом АСМ

Отбор образцов для исследования методом АСМ

Подготовка клеток HT29 для АСМ

Получение изображений с помощью атомно-силовой микроскопии

Дополнительные каналы данных в режиме Ringing mode

Определение механических параметров клетки и надклеточного слоя

Расчет параметров поверхности

Методы машинного обучения

Подготовка данных для анализа

Статистический анализ полученных результатов

Определение взаимной корреляции между параметрами поверхности

Классификация клеточных физиомаркеров для диагностики рака мочевого пузыря

Возможные механизмы возникновения наблюдаемых свойств поверхности клеток

Классификации клеток с различной онкологической агрессивностью

Анализ изображений поверхности клеток

Анализ механических свойств клеток

Сравнение типов классификации клеток

Обсуждение результатов и выводы

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПУБЛИКАЦИИ АВТОРА ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

A375 - клеточная линия эпителиальных клеток меланомы человека, полученная из банка клеток ATCC, номер в каталоге CRL-1619; AFM - atomic-force microscopy;

ALL3 - клеточная линия лимфоцитов от пациента с острым лимфобластным лейкозом;

ATCC - банк клеток American Type Culture Collection;

AUC - статистический показатель, площадь, ограниченная ROC кривой и

осью абсцисс;

BCR-ABL - гибридный ген, связанный с хроническим миелолейкозом; BRAF - мутации в гене BRAF, связанные с развитием меланомы; BSA - бычий сывороточный альбумин (bovine serum albumin); BTA - антиген рака мочевого пузыря (bladder tumor antigen); CD34+ - клеточная фракция с экспрессией мембранного белка CD34; CML - хронический миелоидный лейкоз (chronic myelogenous leukemia); CSK - ген C-terminal src kinase;

CXT - клеточная линия раковых эпителиальных клеток шейки матки человека;

DMEM - питательная среда DMEM (Dulbecco's modified Eagles medium);

ex vivo - проведение экспериментов в живой ткани, перенесённой из

организма в искусственную внешнюю среду;

FBS - телячья сыворотка крови (fetal bovine serum);

FN - ложноотрицательный (false negative);

FP - ложноположительный (false positive);

G0, G1, S, G2 и M - фаза клеточного цикла эукариотических клеток; HBSS - сбалансированный солевой раствор Хэнкса (Hank's balanced salt solution);

HCX - клеточная популяция эпителиальных клеток шейки матки человека;

HEPES - цвиттер-ионный органический буферный агент (4-(2-

гидроксиэтил)-1 -пиперазинэтансульфоновая кислота);

HPV - клеточная линия эпителиальных клеток шейки матки человека,

зараженная вирусом папилломы человека HPV-16;

HT29 - клеточная линия колоректальной аденокарциномы человека;

HT29 CSK-shRNA - shPHK-трансфицированные клетки НТ29 с 30-50%

подавлением гена C-terminal src kinase;

in vitro - методика выполнения экспериментов в искусственных условиях, вне организма или естественной среды;

IRB - комитет по этике биомедицинских исследований (Institutional Review Board);

KSFM - бессывороточная среда для кератиноцитов (Keratinocyte serum-free medium);

LDPE - полиэтилен низкой плотности (low density polyethylene); LMW-PTP - низкомолекулярная протеиновая тирозинфосфатаза (low molecular weight protein tyrosine phosphatases);

MCF-7 - эпителиоподобная клеточная линия, полученная из инвазивной аденокарциномы протоков молочной железы человека; MEM Игла - питательная среда Игла (Eagle's Minimum Essential Medium); one-way ANOVA - однофакторный дисперсионный тест (one-way analysis of variance);

PBS - фосфатно-солевой буферный раствор (phosphate-buffered saline); PeakForce QNM - PeakForce Quantitative Nanomechanics; PS - полистирол (polystyrene);

QBSF-60 - питательная среда для стволовых клеток (Quality Biological Inc, № в каталоге 160-204-101);

QNM - Quantitative Nanomechanics;

RBF - радиально-базисная функция (radial basis function);

RM - Ringing mode (предложенная в работе субрезонансная методика

АСМ);

RMS - среднеквадратичное значение (root mean square); RM-адгезия - величина адгезии, получаемая в методике Ringing mode; RM-восстановленная адгезия - величина восстановленной адгезии, получаемая в методике Ringing mode (эти и похожие названия относятся к данным, получаемым в методике Ringing mode);

ROC - операционная характеристика приемника (receiver operating characteristic);

RPMI - питательная среда созданная в институте Розуэлл Парк Мемориал (Roswell Park Memorial Institute medium);

SPIP - Scanning Probe Image Processor (программное обеспечение фирмы Image Metrology A/S, Denmark, используемое для обработки данных АСМ); TN - истинно отрицательный (true negative); TP - истинно положительный (true positive);

VUC - визуальное цитологическое исследование клеточного материала в

моче с помощью оптической микроскопии (voided urine cytology);

АСМ - атомно-силовая микроскопия;

ВПЧ - вирус папилломы человека;

ГК - гиалуроновая кислота;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

ЗФБ - зеленый флуоресцентный белок;

ИТК - ингибитор тирозинкиназы;

ЛСК - лейкозные стволовые клетки;

МКПК - мононуклеарные клетки периферической крови;

РНК - рибонуклеиновая кислота;

СЗМ - сканирующая зондовая микроскопия;

СЭМ - сканирующая электронная микроскопия;

ТУРО - трансуретральная резекция опухоли;

УП - удвоение популяции (клеток);

ХМЛ - хронический миелоидный лейкоз.

ВВЕДЕНИЕ

Данная работа посвящена разработке комплекса приборно-технологических и биофизических методов для исследования механических свойств живых клеток и параметров надклеточного слоя (структуры, объединяющей в себе перицеллюлярный слой и мембранные выступы), а также адгезионных свойств клеточной поверхности. Основная часть работы направлена на анализ возможности использования получаемых физических свойств клеток, так называемых физиомаркеров - характерных физических параметров как для диагностики раковых заболеваний человека, так и для идентификации различных клеточных патологий.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Методы сканирующей зондовой микроскопии для оценки физических маркеров раковых заболеваний»

Актуальность работы

Механические свойства клеток являются важнейшим фактором, который определяет практически все аспекты их жизнедеятельности. Большинство типов клеток в человеческом организме, такие как мышечные, эпителиальные, клетки крови, нейроны и другие, находятся в непрерывно меняющейся силовой среде, т.е. постоянно подвергаются воздействию различных внешних механических сил. Поэтому механика клеток является ключевым фактором, который определяет не только их подвижность и функциональность, но и многие процессы в организме [1-3]. Изменение механики клеток может изменить их биологическое поведение. В связи с этим вполне можно ожидать, что изменение механических свойств может привести к различным патологиям или заболеваниям и наоборот.

В настоящее время существует несколько методов изучения клеточной механики, которые базируются на применении атомно-силовой микроскопии (АСМ) [4-6], оптического пинцета [7-9], магнитного пинцета [10, 11] или микропипеток [12, 13]. И не смотря на то, что каждый подход имеет свои плюсы и минусы, атомно-силовая микроскопия, вероятно,

является одной из наиболее универсальных методик как для исследования мягких материалов в целом [14-16], так и биологических объектов в частности [17-19].

Ранее уже было предложено использовать механические свойства клеток - в качестве так называемого маркера для диагностики раковых заболеваний [5, 20-23], но в то же время существует ряд работ, которые показывают возникающую неоднозначность при использовании, например, модуля упругости для диагностирования рака [24, 25]. Это может быть связано с тем, что, как правило, для расчета механических свойств используются модели, не предназначенные для оценки модуля упругости таких сложных систем как клетки. Таким образом, существует необходимость в разработке методов, позволяющих достоверно и точно измерять механические свойства живых клеток.

Еще одной значимой проблемой в настоящее время является отсутствие общепринятых клинических методов, позволяющих определять степень злокачественности на уровне отдельных клеток. Например, существующие методы определения биомаркеров не основываются на анализе отдельных клеток [26]. Спектроскопические оптические методы (рамановский, метод сопряженных волн, инфракрасный, флуоресцентный) хотя и позволяют анализировать отдельные клетки, но обладают очень слабым пространственным разрешением и все еще находятся в стадии разработки [27, 28]. Решение этой проблемы может помочь своевременно назначать эффективное лечение в том случае, когда для анализа доступно только небольшое количество клеток, тем самым значительно снижая смертность от рака [29-31].

Также необходимо отметить, что одним из основных направлений исследований в области диагностики рака в течение последних десятилетий был поиск специфических биомаркеров, позволяющих определять наличие раковых новообразований [32]. Однако наличие вариативности этих

параметров, даже в одних и тех же раковых опухолях на разных стадиях злокачественности, значительно замедлило продвижение в этом направлении [33].

В связи с этим разработка современных методов диагностики, основанных на физических маркерах заболеваний, в том числе и на уровне одиночных клеток, может стать одним из актуальных направлений развития современной диагностической медицины. В качестве таких физиомаркеров могут выступать как уже предложенные ранее механические свойства клеток, так и другие физические параметры, получаемые, например, при анализе изображений поверхности клеток. Более того, комбинирование физических параметров, в том числе и с использованием алгоритмов машинного обучения, может позволить проводить идентификацию клеточного фенотипа с еще большей точностью.

Таким образом, разработка методов анализа физических свойств клеток может стать важным инструментом как для получения новых фундаментальных представлений о клеточных патологиях, так и способствовать созданию современных методов диагностики, основанных на физических маркерах заболеваний.

Цель и задачи работы

Целью данной работы является разработка комплекса приборно-технологических и биофизических методов измерения модуля упругости живых клеток, параметров надклеточного слоя и локальных адгезионных и механических свойств клеточной поверхности, а также анализ возможности использования получаемых физических параметров в качестве физиомаркеров для диагностики раковых заболеваний человека и идентификации клеточных патологий.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методику определения модуля упругости клеток на основе данных силовых кривых подвода-отвода, получаемых с помощью атомно-силовой микроскопии, при учете влияния надклеточного слоя.

В рамках данной задачи требуется: а) разработать методику расчета модуля упругости клеток в случае использования как конического, так и сферического зонда при учете влияния неэластичного надклеточного слоя; б) расширить полученные модели на случай клеток, слабо связанных с подложкой; в) разработать методику определения модуля упругости клеток в случае, когда толщина надклеточного слоя превышает вертикальный размер используемого зонда; г) провести анализ самосогласованности предложенных моделей, основываясь на поведении модуля упругости при изменении величины деформации/силы.

2. Исследовать возможность применения параметров надклеточной структуры и модуля упругости клеток в качестве физиомаркеров для выявления инициирующих раковых клеток.

В рамках данной задачи требуется: а) определить модуль упругости и параметры надклеточной структуры для клеток CD34+ G0 и CD34+ G1, полученных от больных хроническим миелоидным лейкозом; б) выявить физиомаркеры, основанные на значениях модуля упругости клеток и параметров надклеточного слоя и позволяющие определять «спящие» стволовые миелоидные клетки в обогащенных CD34+ клеточных фракциях; в) определить модуль упругости и параметры надклеточного слоя для меланоцитов, непосредственно инициирующих возникновение раковой опухоли в модельном организме рыбок данио-рерио BRAFV600E/P53. Оценить возможность использования физических параметров клетки для выявления инициирующих рак меланоцитов; г) проверить самосогласованность результатов, получаемых с помощью

модели, учитывающей наличие надклеточного слоя и данных, получаемых в классической модели Герца.

3. Проанализировать применимость параметра фрактальной размерности адгезионных изображений клеточной поверхности в качестве физиомаркера для идентификации предраковых и раковых клеток в клеточных культурах (in vitro).

В рамках данной задачи требуется: а) разработать метод фрактального анализа карт клеточной поверхности; б) на примере модельных предраковых (бессмертных) HPV-16 и раковых CXT клеточных линий, а также нормальных эпителиальных клеток шейки матки человека (HCX) проанализировать возможность использования фрактальной размерности как потенциального биофизического маркера предраковых и раковых клеток; в) оценить стабильность фрактальных параметров клеточной поверхности при различных условиях получения изображений (условий сканирования); г) исследовать поведение параметров фрактальности адгезионных карт поверхности клеток и определить роль параметра мультифрактальности для дифференциации типов клеток.

4. На базе субрезонансного режима сканирования атомно-силового микроскопа разработать методику визуализации адгезионных и вязкоупругих характеристик поверхности биологических и полимерных материалов.

В рамках данной задачи требуется: а) провести анализ информации, возникающей при отрыве зонда АСМ от поверхности образца и последующих затухающих резонансных колебаниях кантилевера; б) спроектировать аппаратно-программный комплекс, позволяющий в реальном времени обрабатывать сигналы изгиба кантилевера и положения образца при работе в субрезонансном режиме; в) разработать методику расчета параметров, характеризующих взаимодействие зонда с

поверхностью образца в момент отрыва зонда, а именно, восстановленную адгезию, потерю энергии при отрыве зонда, адгезионную деформацию и расстояние отрыва зонда от поверхности образца; г) с помощью разработанной методики провести экспериментальные исследования локальных адгезионных и вязкоупругих характеристик поверхности фиксированных эпителиальных клеток, корнеоцитов и полимерных материалов.

5. Разработать подход использования методов машинного обучения для идентификации клеточных физиомаркеров, позволяющих диагностировать раковые клетки и классифицировать их онкологическую агрессивность.

В рамках данной задачи требуется: а) с помощью методов машинного обучения провести отбор физиомаркеров, основанных на параметрах изображений клеточной поверхности и позволяющих идентифицировать как раковые клетки, так и клетки с различной онкологической агрессивностью; б) исследовать возможность применения выделенных физиомаркеров для идентификации раковых клеток в клинических образцах; в) проанализировать качество определения фенотипа раковых клеток с помощью физиомаркеров, идентифицированных методами машинного обучения; г) сравнить возможность классификации клеточного фенотипа с помощью адгезионных физиомаркеров и физиомаркеров, основанных на механических параметрах клетки.

Научная новизна

1. В работе впервые была предложена методика измерения модуля упругости тела клеток с учетом вклада неэластичного надклеточного слоя, включающего в себя мембранные выступы и перицеллюлярный слой, для зондов конической формы, для зондов сферической формы в случае, когда клетка слабо прикреплена к поверхности, а также в случае,

когда толщина надклеточного слоя превышает вертикальный размер зонда. Впервые была предложена модель, позволяющая рассчитывать характерные параметры надклеточного слоя, а именно, эффективную толщину слоя и объемную плотность, выраженную через количество привитых молекул на единицу площади для слабо закрепленных клеток и в случае клеток, для которых толщина надклеточного слоя превышает вертикальный размер зонда.

2. Предложенные методы расчета механических свойств клеток и параметров надклеточного слоя позволили впервые обнаружить увеличение эффективной объемной молекулярной плотности надклеточного слоя для «спящих» стволовых миелоидных клеток по сравнению с другими фракциями стволовых миелоидных клеток в обогащенных CD34+ клеточных фракциях. Этот параметр был предложен в качестве физиомаркера для детектирования «спящей» фазы G0 миелоидных клеток. Впервые было показано влияние клеточной плотности в культивационной среде (количество клеток на 1 мл среды) на механические свойства и параметры надклеточного слоя клеток клеточной линии ALL3 острого лимфобластного лейкоза. Разработанные методы оценки модуля упругости клеток впервые были использованы для выявления клеток, инициирующих раковую опухоль в модельном организме рыб данио-рерио с индуцированной мутацией BRAF, провоцирующей возникновение меланомы.

3. Впервые было показано, что фрактальность и мультифрактальность адгезионных изображений клеточной поверхности может быть использована как физиомаркер для выявления предраковых и раковых эпителиальных клеток шейки матки человека в клеточных культурах (in vitro).

4. Разработан новый экспериментальный метод для исследования адгезионных и вязкоупругих свойств биологических и полимерных

материалов на наномаштабе. Данный метод позволяет получать ряд новых, недоступных ранее физических характеристик поверхности образца, а именно: восстановленную адгезию, величину потерь энергии при отрыве зонда от поверхности, адгезионную деформацию материала, эффективную длину молекул, прикрепленных к поверхности, а также адгезионную высоту. Все эти новые типы данных могут быть получены одновременно с данными, уже существующими в субрезонансных методиках.

5. Впервые в ходе клинического испытания новый метод получения адгезионных карт поверхности клеток совместно с методами машинного обучения был применен для идентификации физиомаркеров, позволяющих с высокой точностью выявлять раковые эпителиальные клетки мочевого пузыря в образцах, полученных от людей. Было показано, что точность предложенного метода достигает 94%, что существенно выше, чем для клинически применяемого в настоящее время метода цистоскопии (77%).

6. Впервые предложенный метод машинного анализа данных был использован для идентификации генетически различных клеточных линий одного и того же типа клеток, отличающихся различной степенью неопластической агрессивности. На основе полученных результатов были выделены физиомаркеры, позволяющие проводить классификацию клеточного фенотипа на уровне отдельных клеток для клеточной линии колоректального рака человека НТ29.

Теоретическая и практическая значимость работы

Представленные в данной работе методики анализа механических свойств живых клеток позволяют получать количественные значения модуля упругости тела клетки и одновременно информацию о свойствах неэластичного надклеточного слоя, что, в свою очередь, дает возможность

идентифицировать клеточные физиомаркеры, которые могут применяться для диагностики раковых заболеваний человека. Помимо этого, описанный подход может быть использован для выявления клеточных патологий, выходящих за рамки рака, а также для мониторинга реакции единичных клеток на различные лекарственные средства, так называемую клеточную фармакологию. Также можно отметить еще один важный для практики результат, а именно, возможность дифференцировать механику клеток и надклеточного слоя с целью потенциальной персонализации будущих методов лечения заболеваний.

В данной работе также предложен новый подход, основанный на фрактальном анализе карт неспецифической (физической) адгезии между зондом АСМ и поверхностью фиксированных клеток, который может быть использован для повышения точности раннего диагностирования рака шейки матки человека при жидкостных цитологических исследованиях. Существующие скрининговые исследования, как правило, не позволяют однозначно идентифицировать возникновение злокачественных изменений при наличии «подозрительных» клеток, выявляемых с помощью стандартной оптической микроскопии. Дополнительный анализ таких клеток методами атомно-силовой микроскопии может позволить идентифицировать единичные предраковые/раковые эпителиальные клетки шейки матки без дополнительной биопсии ткани.

Разработанный новый экспериментальный метод для исследования вязкоупругих и адгезионных свойств мягких материалов позволяет получать ряд новых и уникальных характеристик поверхности, а именно, восстановленную адгезию, величину потерь энергии при отрыве зонда от поверхности, адгезионную деформацию материала, эффективную длину молекул, прикрепленных к поверхности, а также адгезионную высоту, что дает возможность количественной оценки ранее недоступных параметров многих полимерных и биоматериалов.

Помимо этого, разработанная методика позволяет непосредственно измерять энергию разрыва молекулярных связей в момент отрыва зонда АСМ от поверхности образца, что в случае жесткого крепления молекул одновременно и к подложке, и к зонду дает возможность напрямую получать энергию их связи.

Предложенные в данной работе методы идентификации физиомаркеров раковых эпителиальных клеток делают возможным проводить неинвазивный скрининг рака мочевого пузыря человека. Проведенное тестовое клиническое испытание подтвердило возможность применение описанного метода, который может быть использован в целях предварительного скрининга, например, совместно с уже имеющимися методами цистоскопии.

Предложенная методика также может применяться для выявления и других видов рака, при которых клетки или жидкие среды организма могут быть получены для анализа без необходимости инвазивной биопсии, например, рака верхних мочевых путей, мочеиспускательного канала, колоректального и других видов рака желудочно-кишечного тракта, рака шейки матки и дыхательных путей человека. В связи с этим можно предположить, что такой подход может стать новым направлением в современной медицинской диагностике.

Методология и методы исследования

Экспериментальные данные силовых кривых подвода-отвода были получены с помощью атомно-силовых микроскопов Dimension 3100 (Veeco\Bruker, Santa Barbara, CA, USA) с контроллером Nanoscope V и дополнительным сканером с обратной связью nPoint (nPoint, Middleton, WI, USA) (с диапазоном сканирования 200мкм х 200мкм х 25 мкм, XYZ); Bioscope Catalyst (Bruker, Santa Barbara, CA, USA) совмещенным с конфокальным микроскопом Nikon U2000 Eclipse C1 (Nikon, Melville, NY,

USA); Icon (Bruker, Santa Barbara, CA, USA) и Asylum Research MFP-3D-Bio AFM (Asylum Research/Oxford Instruments, Santa Barbara, CA, USA) совмещенным с инвертированным оптическим микроскопом Nikon Eclipse Ti (Nikon, Melville, NY, USA). Атомно-силовой микроскоп Dimension 3100 был оснащен встроенным видеомикроскопом, позволяющим позиционировать зонд АСМ в области от 150x110 до 675x510 мкм2 с максимальным разрешением до 1.5 мкм. Микроскоп Icon был оборудован встроенной оптической системой, оснащенной 5-мегапиксельной цифровой камерой, позволяющей получать изображения размером от 180x180 до 1465x1465 мкм2.

Для получения адгезионных и высотных карт клеточной поверхности использовался микроскоп Dimension 3100 с контроллером Nanoscope V и дополнительным сканером с обратной связью nPoint.

В ходе разработки методики визуализации адгезионных и вязкоупругих характеристик поверхности биологических и полимерных материалов был спроектирован и построен аппаратно-программный комплекс на основе атомно-силового микроскопа Icon (Bruker, Santa Barbara, CA, USA), программируемых карт National Instruments серии R (National Instruments, Austin, TX, USA) и языка программирования LabVIEW 2012 и 2015 (National Instruments, Austin, TX, USA). Разработанная методика также была опробована на микроскопе Bioscope Catalyst (Bruker, Santa Barbara, CA, USA) совмещенным с конфокальным микроскопом Nikon U2000 Eclipse C1 (Nikon, Melville, NY, USA) и микроскопе NTEGRA PRIMA (НТ-МДТ Спектрум Инструментс, Зеленоград, Россия).

Сферические зонды были изготовлены с использованием стандартных кантилеверов без зонда NP-010 с V-образной балкой длиной 200 мкм (Bruker, Inc., Santa Barbara, CA, USA). Сфера из диоксида кремния, диаметром 5 мкм (Bangs Labs, Inc., Fishers, IN, USA) была приклеена на кантилевер либо с помощью самого атомно-силового микроскопа, либо с

помощью станции микроманипулятора Micromanipulator Station 6000 (Micromanipulator, Carson City, NV, USA), как описано в работах [34, 35].

Для работы с живыми клетками также применялись зонды DNP-10, SCANASYST-FLUID (Bruker, Santa Barbara, CA, USA) и OMCL-TR400PSA (Olympus Corporation). Для построения карт локальных адгезионных характеристик использовались зонды SCANASYST-AIR, SCANASYST-FLUID (Bruker, Santa Barbara, CA, USA), HMX-10 (Veeco\Bruker, Santa Barbara, CA, USA).

В работе использовались различные типы и линии клеток человека и животных, а именно: клетки аденокарциномы протоков молочной железы человека MCF-7, острого лимфобластного лейкоза ALL3, миелоидные клеток CML CD34+, эпителиальные клетки шейки матки человека HPV-16, CXT, HCX, эпителиальные клетки меланомы человека A375 ATCC CRL-1619, эпителиальные клетки мочевого пузыря, полученные из образцов мочи, клеточные линии колоректального рака человека HT29 и др., полученные из банков клеток и тканей, университетов и клиник Cooperative Human Tissue Network (CHTN, National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA), Tufts Medical School (Boston, MA, USA), American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA), University of Rochester (Rochester, NY, USA), Sloan Kettering Institute (New York, NY, USA), Dartmouth Hitchcock Medical Center (Lebanon, NH, USA) и Cleveland Clinic (Cleveland, OH, USA).

Для моделирования раковых образований на модельных организмах, а также в качестве источника здоровых клеток использовались следующие виды лабораторных животных: рыбы данио-рерио (Zebrafish), беспородные разноцветные морские свинки, голые землекопы (Eterocephalus glaber), крысы (Rattus norvegicus) и др.

Анализ данных проводился с использованием программного обеспечения Bruker NanoScope Analysis 1.4 и 1.5, Image Metrology A/S

-22-

SPIP 6, WSxM (http://www.wsxm.es), National Instruments LabVIEW 2012, 2015 и 2020, MathWorks, Inc. MATLAB R2010a, R2014a и R2018b, Microsoft Inc. Office Excel. Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программного обеспечения OriginLab OriginPro 8, 8.1, 9 и Origin 2015.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработанные методики измерения механических свойств клеток с учетом вклада внешнего неэластичного надклеточного слоя позволяют получать количественное значение модуля упругости (модуль Юнга) тела клетки, а также рассчитать характерные параметры надклеточного слоя, а именно, эффективную толщину слоя и его объемную плотность, выраженную через плотность прививки эффективных молекул на единицу площади поверхности клетки. Показано, что количественные значения модуля упругости клеток можно получить только при учете влияния вклада надклеточного слоя и при использовании данных, собранных с помощью сферического зонда при деформациях, не превышающих 20% от высоты клетки.

2. Использование разработанных методик измерения механических свойств клеток позволяет выявлять разницу в физических свойствах между разными типами клеток одного вида. На примере стволовых миелоидных клеток и клеток меланоцитов показана возможность дифференцирования типа клеток на основании модуля упругости либо параметров надклеточного слоя.

3. Предложенный метод оценки фрактальной размерности адгезионных карт клеточной поверхности позволяет с чувствительностью и специфичностью более 99% идентифицировать предраковые и раковые эпителиальные клетки шейки матки человека in vitro. Анализ поведения фрактальной размерности показывает возникновение хаотической

структуры клеточной поверхности при переходе от предраковых клеток к раковым.

4. Разработанная субрезонансная методика исследования адгезионных и вязкоупругих характеристик поверхности мягких материалов позволяет получать ряд новых, недоступных ранее физических характеристик поверхности, а именно, восстановленную адгезию, величину потерь энергии при отрыве зонда от поверхности, адгезионную деформацию материала, эффективную длину молекул, прикрепленных к поверхности, а также адгезионную высоту. Показано, что новая методика позволяет существенно сократить время получения адгезионных изображений, а также в 2-3 раза увеличить разрешение получаемых изображений при тех же условиях сканирования.

5. Физиомаркеры, основанные на параметрах клеточной поверхности, отобранных с помощью методов машинного обучения, позволяют идентифицировать раковые клетки и клетки с различающейся онкологической агрессивностью. В ходе клинического испытания предложенный метод позволил выявлять раковые эпителиальные клетки мочевого пузыря в образцах, полученных от людей, с точностью 94%.

Личный вклад автора

Представленные в диссертации результаты экспериментальных и теоретических исследований выполнены лично автором или при его непосредственном участии. Автором были предложены модели для расчета модуля упругости клеток, а также параметров надклеточного слоя для всех случаев, представленных в данной работе, за исключением случая простой полусферической геометрии клетки при использовании сферического зонда и при условии, что толщина надклеточной структуры меньше вертикального размера зонда. Автором было написано программное обеспечение на языке LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) для автоматизированной

обработки данных силовых кривых подвода-отвода для всех случаев, приведенных в данной работе.

Автор внес существенный вклад в разработку метода фрактального анализа карт клеточной поверхности и расчета параметров мульти-фрактальности карт локальных физических свойств.

Автор диссертации принимал непосредственно участие в разработке нового экспериментального метода исследования адгезионных и вязкоупругих свойств биологических и полимерных материалов на наномаштабе. Автором был создан аппаратно-программный комплекс, позволяющий проводить измерения локальных адгезионных характеристик поверхности в реальном времени.

Личный вклад автора в работы, указанные в списке публикаций, состоял в разработке экспериментальных методик, создании аппаратно-программных измерительных комплексов, постановке и проведении экспериментов, разработке теоретических моделей, анализе экспериментальных данных и подготовке статей к публикации.

Апробация результатов диссертационной работы

Основные положения диссертации были представлены в 58 докладах на российских и международных конференциях, а также на 5 приглашенных лекциях, включая: Международную школу-конференцию «Сканирующая зондовая микроскопия для биологических систем - 2021, 2022» (Москва, Россия, 2021, 2022), XVI и XV Всероссийскую молодежную научно-инновационную школу «Математика и математическое моделирование» (Саров, Россия, 2021, 2022), 2020 Virtual MRS Spring and Fall Meeting & Exhibit (Boston, USA, 2020), Microscopy & Microanalysis 2020 Virtual Meeting (USA, 2020), XXIII и XXIV Международный симпозиум «Нанофизика и наноэлектроника» (Нижний Новгород, Россия, 2019, 2020), IV International Symposium on «Physics, Engineering and Technologies for Biomedicine»

(Москва, Россия, 2019), Всероссийскую конференцию «Особенности применения сканирующей зондовой микроскопии в вакууме и различных средах» (Черноголовка, Россия, 2019), SPM-2019-RCWDFM Joint International Conference (Екатеринбург, Россия, 2019), APS March Meeting 2019 (Boston, USA, 2019), Pittcon 2018 (Orlando, USA, 2018), Spring 2017 Meeting of the APS New England Section (Worcester, USA, 2017), 250th ACS National Meeting Boston (Boston, USA, 2015), 2013, 2014 и 2015 MRS Fall Meeting & Exhibit (Boston, USA, 2013, 2014, 2015), 7th World Congress of Biomechanics (Boston, USA, 2014), APS March Meeting 2013 (Baltimore, USA, 2013), APS March Meeting 2012 (Boston, USA, 2012), Symposium Engineering in Medicine: Redesigning Cancer Imaging and Therapy (Dartmouth College, Hanover, USA, 2011), 37th Northeast Regional meeting NERM Spring (Potsdam, USA, 2010) и др.

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Докукин Максим Евгеньевич, 2023 год

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Galbraith, C.G. and M.P. Sheetz, Forces on adhesive contacts affect cell function, Current Opinion in Cell Biology, 10 (5), pp. 566-571, (1998).

2. Vogel, V. and M. Sheetz, Local force and geometry sensing regulate cell functions, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 7 (4), pp. 265-275, (2006).

3. Chaudhuri, O. and D.J. Mooney, STEM-CELL DIFFERENTIATION Anchoring cell-fate cues, Nature Materials, 11 (7), pp. 568-569,

4. Cross, S.E., Y.S. Jin, J. Rao, and J.K. Gimzewski, Nanomechanical analysis of cells from cancer patients, Nature Nanotechnology, 2 (12), pp. 780-783, (2007).

5. Lekka, M. and P. Laidler, Applicability of AFM in cancer detection, Nat Nanotechnol, 4 (2), pp. 72; author reply 72-3, (2009).

6. Carl, P. and H. Schillers, Elasticity measurement of living cells with an atomic force microscope: data acquisition and processing, Pflugers Archiv-European Journal of Physiology, 457 (2), pp. 551-559, (2008).

7. Li, J., M. Dao, C.T. Lim, and S. Suresh, Spectrin-level modeling of the cytoskeleton and optical tweezers stretching of the erythrocyte, Biophys J, 88 (5), pp. 3707-19, (2005).

8. Cuvelier, D., I. Derenyi, P. Bassereau, and P. Nassoy, Coalescence of membrane tethers: experiments, theory, and applications, Biophys J, 88 (4), pp. 2714-26, (2005).

9. Gerbal, F., V. Laurent, A. Ott, M.F. Carlier, P. Chaikin, and J. Prost, Measurement of the elasticity of the actin tail of Listeria monocytogenes, Eur Biophys J, 29 (2), pp. 134-40, (2000).

10. Feneberg, W., M. Aepfelbacher, and E. Sackmann, Microviscoelasticity of the apical cell surface of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) within confluent monolayers, Biophys J, 87 (2), pp. 1338-50, (2004).

11. Berrios, J.C., M.A. Schroeder, and R.D. Hubmayr, Mechanical properties of alveolar epithelial cells in culture, J Appl Physiol (1985), 91 (1), pp. 6573, (2001).

12. Linderkamp, O., E. Friederichs, T. Boehler, and A. Ludwig, Age dependency of red blood cell deformability and density: studies in transient erythroblastopenia of childhood, Br J Haematol, 83 (1), pp. 125-9, (1993).

13. Paulitschke, M., G.B. Nash, D.J. Anstee, M.J. Tanner, and W.B. Gratzer, Perturbation of red blood cell membrane rigidity by extracellular ligands, Blood, 86 (1), pp. 342-8, (1995).

14. Dokukin, M.E. and I. Sokolov, Quantitative Mapping of the Elastic Modulus of Soft Materials with HarmoniX and Peak Force QNM AFM Modes, Langmuir, 28 (46), pp. 16060-16071, (2012).

15. Dokukin, M.E. and I. Sokolov, On the Measurements of Rigidity Modulus of Soft Materials in Nanoindentation Experiments at Small Depth, Macromolecules, 45 (10), pp. 4277-4288, (2012).

16. Butt, H.J., B. Cappella, and M. Kappl, Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications, Surface Science Reports, 59 (1-6), pp. 1-152, (2005).

17. Sokolov, I., S. Iyer, V. Subba-Rao, R.M. Gaikwad, and C.D. Woodworth, Detection of surface brush on biological cells in vitro with atomic force microscopy, Applied Physics Letters, 91, pp. 023902-1-3, (2007).

18. Pelling, A.E., S. Sehati, E.B. Gralla, J.S. Valentine, and J.K. Gimzewski, Local nanomechanical motion of the cell wall of Saccharomyces cerevisiae, Science, 305 (5687), pp. 1147-1150, (2004).

19. Sokolov, I., M. Firtel, and G.S. Henderson, In situ high-resolution AFM imaging of biological surfaces, Journal of Vac.Sci.&Tech. B, 14, pp. 674678, (1996).

20. Osmulski, P., D. Mahalingam, M.E. Gaczynska, J. Liu, S. Huang, A.M. Horning, C.M. Wang, I.M. Thompson, T.H.M. Huang, and C.L. Chen,

Nanomechanical Biomarkers of Single Circulating Tumor Cells for Detection of Castration Resistant Prostate Cancer, Prostate, 74 (13), pp. 1297-1307, (2014).

21. Paszek, M.J., N. Zahir, K.R. Johnson, J.N. Lakins, G.I. Rozenberg, A. Gefen, C.A. Reinhart-King, S.S. Margulies, M. Dembo, D. Boettiger, D.A. Hammer, and V.M. Weaver, Tensional homeostasis and the malignant phenotype, Cancer Cell, 8 (3), pp. 241-54, (2005).

22. Rao, J., S. Cross, Y. Jin, and J. Gimzewski, Cellular nanomechanics measured by atomic force microscope as a marker for malignancy in patient body fluid samples, Cancer Cytopathology, 111 (5), pp. 437-437, (2007).

23. Plodinec, M., M. Loparic, C.A. Monnier, E.C. Obermann, R. Zanetti-Dallenbach, P. Oertle, J.T. Hyotyla, U. Aebi, M. Bentires-Alj, R.Y. Lim, and C.A. Schoenenberger, The nanomechanical signature of breast cancer, Nat Nanotechnol, 7 (11), pp. 757-65, (2012).

24. Iyer, S., R.M. Gaikwad, V. Subba-Rao, C.D. Woodworth, and I. Sokolov, AFM Detects Differences in the Surface Brush on Normal and Cancerous Cervical Cells, Nature Nanotechnology, 4, pp. 389-393, (2009).

25. Bastatas, L., D. Martinez-Marin, J. Matthews, J. Hashem, Y.J. Lee, S. Sennoune, S. Filleur, R. Martinez-Zaguilan, and S. Park, AFM nano-mechanics and calcium dynamics of prostate cancer cells with distinct metastaticpotential, Biochim Biophys Acta, 1820 (7), pp. 1111-20, (2012).

26. Costa-Pinheiro, P., D. Montezuma, R. Henrique, and C. Jeronimo, Diagnostic and prognostic epigenetic biomarkers in cancer, Epigenomics, 7 (6), pp. 1003-15, (2015).

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

Bigio, I.J. and S.G. Bown, Spectroscopic sensing of cancer and cancer therapy: current status of translational research, Cancer Biol Ther, 3 (3), pp. 259-67, (2004).

Auner, G.W., S.K. Koya, C. Huang, B. Broadbent, M. Trexler, Z. Auner, A. Elias, K.C. Mehne, and M.A. Brusatori, Applications of Raman spectroscopy in cancer diagnosis, Cancer Metastasis Rev, 37 (4), pp. 691717, (2018).

Liu, A., Q. Wu, D. Peng, I. Ares, A. Anadon, B. Lopez-Torres, M.R. Martinez-Larranaga, X. Wang, and M.A. Martinez, A novel strategy for the diagnosis, prognosis, treatment, and chemoresistance of hepatocellular carcinoma: DNA methylation, Med Res Rev, 40 (5), pp. 1973-2018, (2020). Asante, D.B., L. Calapre, M. Ziman, T.M. Meniawy, and E.S. Gray, Liquid biopsy in ovarian cancer using circulating tumor DNA and cells: Ready for prime time?, Cancer Lett, 468, pp. 59-71, (2020).

Kowalik, J., Faecal tests in the early detection of colorectal cancer, Prz Gastroenterol, 15 (3), pp. 200-206, (2020).

Sarhadi, V.K. and G. Armengol, Molecular Biomarkers in Cancer, Biomolecules, 12 (8), (2022).

Weinberg, R.A., Coming full circle-from endless complexity to simplicity and back again, Cell, 157 (1), pp. 267-71, (2014).

Berdyyeva, T.K., C.D. Woodworth, and I. Sokolov, Human epithelial cells increase their rigidity with ageing in vitro: direct measurements, Physics in Medicine and Biology, 50 (1), pp. 81-92, (2005). Volkov, D.O., P.R.V. Dandu, H. Goodman, B. Santora, and I. Sokolov, Influence of Adhesion of Silica and Ceria Abrasive Nanoparticles on Chemical-Mechanical Planarization of Silica Surfaces, Applied Surface Science, 257 (20), pp. 8518-8524 (2011).

Ulrich, P. and X. Zhang, Pharmacological reversal of advanced glycation end-product-mediated protein crosslinking, Diabetologia, 40, pp. S157-S159, (1997).

Perry, G. and M.A. Smith, Active Glycation in Neurofibrillary pathology of Alzheimer's Disease: N-(Carboxymethyl) Lysine and Hexitol-Lysine, Free Radical Biology & Medicine, 31, pp. 175-180, (2001). Bucala, R. and A. Cerami, Advanced Glycosylation: Chemistry, Biology, and Implications for Diabetes and Aging, Advances in Pharmacology, 23, pp. 1-34, (1992).

Nash, G.B., E. O'Brien, E.C. Gordon-Smith, and J.A. Dormandy,

Abnormalities in the mechanical properties of red blood cells caused by Plasmodium falciparum, Blood, 74 (2), pp. 855-61, (1989). Mohanty, S.K., A. Uppal, and P.K. Gupta, Self-rotation of red blood cells in optical tweezers: prospects for high throughput malaria diagnosis, Biotechnol Lett, 26 (12), pp. 971-4, (2004).

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

Huang, S. and D.E. Ingber, Cell tension, matrix mechanics, and cancer development, Cancer Cell, 8 (3), pp. 175-6, (2005). Suresh, S., Biomechanics and biophysics of cancer cells, Acta Biomaterialia, 3 (4), pp. 413-38, (2007).

Lekka, M., P. Laidler, D. Gil, J. Lekki, Z. Stachura, and A.Z. Hrynkiewicz, Elasticity of normal and cancerous human bladder cells studied by scanning force microscopy, Eur Biophys J, 28 (4), pp. 312-6, (1999). Lekka, M., D. Gil, K. Pogoda, J. Dulinska-Litewka, R. Jach, J. Gostek, O. Klymenko, S. Prauzner-Bechcicki, Z. Stachura, J. Wiltowska-Zuber, K. Okon, and P. Laidler, Cancer cell detection in tissue sections using AFM, Archives of Biochemistry and Biophysics, 518 (2), pp. 151-156, (2012). Li, Q.S., G.Y. Lee, C.N. Ong, and C.T. Lim, AFM indentation study of breast cancer cells, Biochem Biophys Res Commun, 374 (4), pp. 609-13, (2008).

Zhou, Z.L., A.H. Ngan, B. Tang, and A.X. Wang, Reliable measurement of elastic modulus of cells by nanoindentation in an atomic force microscope, J Mech Behav Biomed Mater, 8, pp. 134-42, (2012). Hoh, J.H. and C.A. Schoenenberger, Surface morphology and mechanical properties of MDCK monolayers by atomic force microscopy, J Cell Sci, 107 ( Pt 5), pp. 1105-14, (1994).

Tranchida, D., S. Piccarolo, and M. Soliman, Nanoscale mechanical characterization of polymers by AFMnanoindentations: Critical approach to the elastic characterization, Macromolecules, 39 (13), pp. 4547-4556, (2006).

Bischoff, G., A. Bernstein, D. Wohlrab, and H.J. Hein, Imaging living chondrocyte surface structures with AFM contact mode, Methods Mol Biol, 242, pp. 105-24, (2004).

Alonso, J.L. and W.H. Goldmann, Feeling the forces: atomic force

microscopy in cell biology, Life Sciences, 72 (23), pp. 2553-2560, (2003).

Lekka, M., D. Gil, K. Pogoda, J. Dulinska-Litewka, R. Jach, J. Gostek, O.

Klymenko, S. Prauzner-Bechcicki, Z. Stachura, J. Wiltowska-Zuber, K.

Okon, and P. Laidler, Cancer cell detection in tissue sections using AFM,

Arch Biochem Biophys, 518 (2), pp. 151-6, (2012).

Clarris, B.J. and J.R. Fraser, On the pericellular zone of some mammalian

cells in vitro, Exp Cell Res, 49 (1), pp. 181-93, (1968).

Scrimgeour, J., L.T. McLane, P.S. Chang, and J.E. Curtis, Single-Molecule

Imaging of Proteoglycans in the Pericellular Matrix, Biophysical Journal,

113 (11), pp. 2316-2320, (2017).

Laurent, T.C. and J.R. Fraser, Hyaluronan, FASEB J, 6 (7), pp. 2397-404, (1992).

Rilla, K., R. Tiihonen, A. Kultti, M. Tammi, and R. Tammi, Pericellular hyaluronan coat visualized in live cells with a fluorescent probe is

scaffolded by plasma membrane protrusions, J Histochem Cytochem, 56 (10), pp. 901-10, (2008).

56. Cohen, M., E. Klein, B. Geiger, and L. Addadi, Organization and adhesive properties of the hyaluronan pericellular coat of chondrocytes and epithelial cells, Biophysical Journal, 85 (3), pp. 1996-2005, (2003).

57. Goldberg, R.L. and B.P. Toole, Pericellular coat of chick embryo chondrocytes: structural role of hyaluronate, J Cell Biol, 99 (6), pp. 211422, (1984).

58. Evanko, S.P., S. Potter-Perigo, P.Y. Johnson, and T.N. Wight, Organization of hyaluronan and versican in the extracellular matrix of human fibroblasts treated with the viral mimetic poly I:C, J Histochem Cytochem, 57 (11), pp. 1041-60, (2009).

59. Jones, L.M.H., M.J. Gardner, J.B. Catterall, and G.A. Turner, Hyaluronic-Acid Secreted by Mesothelial Cells - a Natural Barrier to Ovarian-Cancer Cell-Adhesion, Clinical & Experimental Metastasis, 13 (5), pp. 373-380, (1995).

60. Goldberg, R.L. and B.P. Toole, Hyaluronate coat formation and cell spreading in rat fibrosarcoma cells, Exp Cell Res, 151 (1), pp. 258-63, (1984).

61. Kosaki, R., K. Watanabe, and Y. Yamaguchi, Overproduction of hyaluronan by expression of the hyaluronan synthase Has2 enhances anchorage-independent growth and tumorigenicity, Cancer Res, 59 (5), pp. 1141-5, (1999).

62. Itano, N., F. Atsumi, T. Sawai, Y. Yamada, O. Miyaishi, T. Senga, M. Hamaguchi, and K. Kimata, Abnormal accumulation of hyaluronan matrix diminishes contact inhibition of cell growth and promotes cell migration, Proc Natl Acad Sci U S A, 99 (6), pp. 3609-14, (2002).

63. Goldberg, R.L. and B.P. Toole, Hyaluronate inhibition of cell proliferation, Arthritis Rheum, 30 (7), pp. 769-78, (1987).

64. Zimmerman, E., B. Geiger, and L. Addadi, Initial stages of cell-matrix adhesion can be mediated and modulated by cell-surface hyaluronan, Biophysical Journal, 82 (4), pp. 1848-1857, (2002).

65. Richards, J.S., Ovulation: New factors that prepare the oocyte for fertilization, Molecular and Cellular Endocrinology, 234 (1), pp. 75-79, (2005).

66. Chen, W.Y. and G. Abatangelo, Functions of hyaluronan in wound repair, Wound Repair Regen, 7 (2), pp. 79-89, (1999).

67. Jiang, D., J. Liang, J. Fan, S. Yu, S. Chen, Y. Luo, G.D. Prestwich, M.M. Mascarenhas, H.G. Garg, D.A. Quinn, R.J. Homer, D.R. Goldstein, R. Bucala, P.J. Lee, R. Medzhitov, and P.W. Noble, Regulation of lung injury and repair by Toll-like receptors and hyaluronan, Nat Med, 11 (11), pp. 1173-9, (2005).

68. de la Motte, C.A., V.C. Hascall, J. Drazba, S.K. Bandyopadhyay, and S.A. Strong, Mononuclear leukocytes bind to specific hyaluronan structures on colon mucosal smooth muscle cells treated with polyinosinic acid:polycytidylic acid: inter-alpha-trypsin inhibitor is crucial to structure and function, Am J Pathol, 163 (1), pp. 121-33, (2003).

69. Camenisch, T.D., J.A. Schroeder, J. Bradley, S.E. Klewer, and J.A. McDonald, Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors, Nat Med, 8 (8), pp. 850-5, (2002).

70. Toole, B.P., Hyaluronan: from extracellular glue to pericellular cue, Nat Rev Cancer, 4 (7), pp. 528-39, (2004).

71. Kumar, S. and J.H. Hoh, Modulation of repulsive forces between neurofilaments by sidearm phosphorylation, Biochemical and Biophysical Research Communications, 324 (2), pp. 489-496, (2004).

72. Brown, H.G. and J.H. Hoh, Entropic exclusion by neurofilament sidearms: a mechanism for maintaining interfilament spacing, Biochemistry, 36 (49), pp. 15035-40, (1997).

73. Zhang, L.R., C.B. Underhill, and L.P. Chen, Hyaluronan on the Surface of Tumor-Cells Is Correlated with Metastatic Behavior, Cancer Research, 55 (2), pp. 428-433, (1995).

74. Boehm, H., T.A. Mundinger, C.H.J. Boehm, V. Hagel, U. Rauch, J.P. Spatz, and J.E. Curtis, Mapping the mechanics and macromolecular organization of hyaluronan-rich cell coats, Soft Matter, 5 (21), pp. 43314337, (2009).

75. Zhang, H., S.L. Baader, M. Sixt, J. Kappler, and U. Rauch, Neurocan-GFP fusion protein: a new approach to detect hyaluronan on tissue sections and living cells, J Histochem Cytochem, 52 (7), pp. 915-22, (2004).

76. McLane, L.T., P. Chang, A. Granqvist, H. Boehm, A. Kramer, J. Scrimgeour, and J.E. Curtis, Spatial organization and mechanical properties of the pericellular matrix on chondrocytes, Biophys J, 104 (5), pp. 986-96, (2013).

77. Brehmer, F., H.A. Haenssle, G. Daeschlein, R. Ahmed, S. Pfeiffer, A. Gorlitz, D. Simon, M.P. Schon, D. Wandke, and S. Emmert, Alleviation of chronic venous leg ulcers with a hand-held dielectric barrier discharge plasma generator (PlasmaDerm((R)) VU-2010): results of a monocentric, two-armed, open, prospective, randomized and controlled trial (NCT01415622), J Eur Acad Dermatol Venereol, 29 (1), pp. 148-55, (2015).

78. Fernández, P., L. Heymann, A. Ott, N. Aksel, and P.A. Pullarkat, Shear rheology of a cell monolayer, New Journal of Physics, 9 (11), pp. 419, (2007).

79. Degennes, P.G., Conformations of Polymers Attached to an Interface, Macromolecules, 13 (5), pp. 1069-1075, (1980).

80. Landau, L.D., E.M. Lifshits, A.d.M. Kosevich, and L.P. Pitaevskii, Theory of elasticity. 3rd English ed. Course of theoretical physics. 1986, Oxford Oxfordshire ; New York: Pergamon Press. viii, 187 p.

81. Diaconu, I. and D. Dorohoi, Properties ofpolyurethane thin films, Journal of Optoelectronics and Advanced Materials, 7 (2), pp. 921-924, (2005).

82. Kalpakjian, S. and S.R. Schmid, Manufacturing processes for engineering materials. 5th ed. 2008, Upper Saddle River, N.J.: Pearson Education. xxi, 1018 p.

83. Dogru, S., D. Aydemir, N. Salman, N.N. Ulusu, and B.E. Alaca, Impact of PDMS surface treatment in cell-mechanics applications, J Mech Behav Biomed Mater, 103, pp. 103538, (2020).

84. Adkins, R.T., Information sources in polymers and plastics. Guides to information sources. 1989, London ; New York: Bowker-Saur. x, 313 p.

85. Tang, Z., Y. Wang, P. Podsiadlo, and N.A. Kotov, Biomedical Applications of Layer-by-Layer Assembly: From Biomimetics to Tissue Engineering, Advanced Materials, 18 (24), pp. 3203-3224, (2006).

86. Woodworth, C.D., J. Doniger, and J.A. Dipaolo, Immortalization of Human Foreskin Keratinocytes by Various Human Papillomavirus Dnas Corresponds to Their Association with Cervical-Carcinoma, Journal of Virology, 63 (1), pp. 159-164, (1989).

87. Gaiotti, D., J. Chung, M. Iglesias, M. Nees, P.D. Baker, C.H. Evans, and C.D. Woodworth, Tumor necrosis factor-alpha promotes human papillomavirus (HPV) E6/E7 RNA expression and cyclin-dependent kinase activity in HPV-immortalized keratinocytes by a ras-dependent pathway, Mol Carcinog, 27 (2), pp. 97-109, (2000).

88. Seluanov, A., A. Vaidya, and V. Gorbunova, Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents, J Vis Exp, (44), (2010).

89. Gaikwad, R.M., M.E. Dokukin, K.S. Iyer, C.D. Woodworth, D.O. Volkov, and I. Sokolov, Detection of cancerous cervical cells using physical adhesion offluorescent silica particles and centripetal force, Analyst, 136 (7), pp. 1502-1506, (2011).

90. Iyer, S., C.D. Woodworth, R.M. Gaikwad, Y.Y. Kievsky, and I. Sokolov, Towards Nonspecific Detection of Malignant Cervical Cells with Fluorescent Silica Beads, Small, 5 (20), pp. 2277-2284, (2009).

91. Zhao, M.H., C. Srinivasan, D.J. Burgess, and B.D. Huey, Rate- and depth-dependent nanomechanical behavior of individual living Chinese hamster ovary cells probed by atomic force microscopy, Journal of Materials Research, 21 (8), pp. 1906-1912, (2006).

92. Hertz, H.R., Ueber die Berührung fester elastischer Körper (On Contact Between Elastic Bodies), in Journal für die reine und angewandte Mathematik (Crelle's Journal). 1882. p. 156.

93. Gruverman, A., O. Auciello, and H. Tokumoto, Imaging and control of domain structures in ferroelectric thin films via scanning force microscopy, Annual Review of Materials Science, 28 (1), pp. 101-123, (1998).

94. Sokolov, I., S. Iyer, and C.D. Woodworth, Recover of Elasticity of Aged Human Epithelial Cells In-Vitro, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine (Nanomedicine), 2, pp. 31- 36, (2006).

95. Sneddon, I.N., The relation between load and penetration in the axisymmetric Boussinesq problem for a punch of arbitrary profile, Int. J. Eng. Sci., 3, pp. 47-57, (1965).

96. Guz, N., M. Dokukin, V. Kalaparthi, and I. Sokolov, If Cell Mechanics Can Be Described by Elastic Modulus: Study of Different Models and Probes Used in Indentation Experiments, Biophysical Journal, 107 (3), pp. 564575, (2014).

97. Israelachvili, J.N., Intermolecular and Surface Forces 3rd ed. 2011, Burlington, MA: Academic. Press.

98. Dokukin, M.E., N.V. Guz, and I. Sokolov, Quantitative Study of the Elastic Modulus of Loosely Attached Cells in AFM Indentation Experiments, Biophysical Journal, 104 (10), pp. 2123-2131, (2013).

99. O'Shea, S.J., M.E. Welland, and T. Rayment, An atomic force microscope study of grafted polymers on mica, Langmuir, 9 (7), pp. 1826-1835, (1993).

100. Dokukin, M., Y. Ablaeva, V. Kalaparthi, A. Seluanov, V. Gorbunova, and I. Sokolov, Pericellular Brush and Mechanics of Guinea Pig Fibroblast Cells Studied with AFM, Biophysical Journal, 111 (1), pp. 236-246, (2016).

101. Fuhrmann, A., J.R. Staunton, V. Nandakumar, N. Banyai, P.C.W. Davies, and R. Ros, AFM stiffness nanotomography of normal, metaplastic and dysplastic human esophageal cells, Physical Biology, 8 (1), (2011).

102. Li, H. and J.J. Vlassak, Determining the elastic modulus and hardness of an ultra-thin film on a substrate using nanoindentation, Journal of Materials Research, 24 (3), pp. 1114-1126, (2009).

103. King, R.B., Elastic Analysis of Some Punch Problems for a Layered Medium, International Journal of Solids and Structures, 23 (12), pp. 16571664, (1987).

104. Makarova, N., V. Kalaparthi, A. Wang, C. Williams, M.E. Dokukin, C.K. Kaufman, L. Zon, and I. Sokolov, Difference in biophysical properties of cancer-initiating cells in melanoma mutated zebrafish, J Mech Behav Biomed Mater, 107, pp. 103746, (2020).

105. Ani, C.J., J.D. Obayemi, V.O. Uzonwanne, Y. Danyuo, O.S. Odusanya, J. Hu, K. Malatesta, and W.O. Soboyejo, A shear assay study of single normal/breast cancer cell deformation and detachment from poly-di-methyl-siloxane (PDMS) surfaces, Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials, 91, pp. 76-90, (2019).

106. Dufrene, Y.F., D. Martinez-Martin, I. Medalsy, D. Alsteens, and D.J. Muller, Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve-based AFM, Nature Methods, 10 (9), pp. 847-854, (2013).

107. Haase, K. and A.E. Pelling, Investigating cell mechanics with atomic force microscopy, Journal of the Royal Society Interface, 12 (104), (2015).

108. Virjula, S., F.H. Zhao, J. Leivo, S. Vanhatupa, J. Kreutzer, T.J. Vaughan, A.M. Honkala, M. Viehrig, C.A. Mullen, P. Kallio, L.M. McNamara, and S. Miettinen, The effect of equiaxial stretching on the osteogenic differentiation and mechanical properties of human adipose stem cells, Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials, 72, pp. 3848, (2017).

109. Wu, P.-H., D.R.-B. Aroush, A. Asnacios, W.-C. Chen, M.E. Dokukin, B.L. Doss, P. Durand-Smet, A. Ekpenyong, J. Guck, N.V. Guz, P.A. Janmey, J.S.H. Lee, N.M. Moore, A. Ott, Y.-C. Poh, R. Ros, M. Sander, I. Sokolov, J.R. Staunton, N. Wang, G. Whyte, and D. Wirtz, A comparison of methods to assess cell mechanical properties, Nature Methods, 15 (7), pp. 491-498, (2018).

110. Boehm, H., T.A. Mundinger, C.H.J. Schmitz, V. Hagel, J.E. Curtis, and J.P. Spatz, Biophysics of the Hyaluronan-Rich Pericellular Coat, Biophysical Journal, 96 (3), pp. 644a-644a, (2009).

111. Simon, M., M. Dokukin, V. Kalaparthi, E. Spedden, I. Sokolov, and C. Staii, Load Rate and Temperature Dependent Mechanical Properties of the Cortical Neuron and Its Pericellular Layer Measured by Atomic Force Microscopy, Langmuir, 32 (4), pp. 1111-1119, (2016).

112. Sokolov, I. and M.E. Dokukin, AFM Indentation Analysis of Cells to Study Cell Mechanics and Pericellular Coat, Nanoscale Imaging: Methods and Protocols, 1814, pp. 449-468, (2018).

113. Targosz-Korecka, M., M. Jaglarz, K.E. Malek-Zietek, A. Gregorius, A. Zakrzewska, B. Sitek, Z. Rajfur, S. Chlopicki, and M. Szymonski, AFM-based detection of glycocalyx degradation and endothelial stiffening in the db/db mouse model of diabetes, Scientific Reports, 7, (2017).

114. Sokolov, I., M.E. Dokukin, and N.V. Guz, Method for quantitative measurements of the elastic modulus of biological cells in AFM indentation experiments, Methods, 60 (2), pp. 202-213, (2013).

115. Faderl, S., M. Talpaz, Z. Estrov, S. O'Brien, R. Kurzrock, and H.M. Kantarjian, Mechanisms of disease - The biology of chronic myeloid leukemia, New England Journal of Medicine, 341 (3), pp. 164-172, (1999).

116. Clarkson, B., A. Strife, D. Wisniewski, C.L. Lambek, and C. Liu, Chronic myelogenous leukemia as a paradigm of early cancer and possible curative strategies, Leukemia, 17 (7), pp. 1211-1262, (2003).

117. Jemal, A., R. Siegel, J.Q. Xu, and E. Ward, Cancer Statistics, 2010, Ca-a Cancer Journal for Clinicians, 60 (5), pp. 277-300, (2010).

118. Sasaki, K., S.S. Strom, S. O'Brien, E. Jabbour, F. Ravandi, M. Konopleva, G. Borthakur, N. Pemmaraju, N. Daver, S.R. Pierce, H.M. Kantarjian, and J.E. Cortes, Chronic Myeloid Leukemia in Chronic Phase: Survival in the Era of Tyrosine Kinase Inhibitors Is Similar to That of the General Population in All Age Groups, Blood, 124 (21), (2014).

119. Jabbour, E. and H. Kantarjian, Chronic myeloid leukemia: 2014 update on diagnosis, monitoring, and management, American Journal of Hematology, 89 (5), pp. 547-556, (2014).

120. Breccia, M., F. Efficace, G. Colafigli, E. Scalzulli, A. Di Prima, M. Martelli, and R. Fo, Tyrosine kinase inhibitor discontinuation in the management of chronic myeloid leukemia: a critical review of the current practice, Expert Review of Hematology, 13 (12), pp. 1311-1318, (2020).

121. Stuckey, R., J.F.L. Rodriguez, and M.T. Gomez-Casares, Discontinuation of Tyrosine Kinase Inhibitors in Patients with Chronic Myeloid Leukemia: a Review of the Biological Factors Associated with Treatment-Free Remission, Current Oncology Reports, (2022).

122. Sierra, J.R., V. Cepero, and S. Giordano, Molecular mechanisms of acquired resistance to tyrosine kinase targeted therapy, Molecular Cancer, 9, (2010).

123. Cogle, C.R., Overcoming Chronic Myeloid Leukemia Stem Cell Resistance to Imatinib by Also Targeting JAK2, Jnci-Journal of the National Cancer Institute, 105 (6), pp. 378-379, (2013).

124. Wisniewski, D., M. Affer, J. Willshire, and B. Clarkson, Further phenotypic characterization of the primitive lineage-CD34+CD38-CD90+CD45RA-hematopoietic stem cell/progenitor cell sub-population isolated from cord blood, mobilized peripheral blood and patients with chronic myelogenous leukemia, Blood Cancer Journal, 1, (2011).

125. Hogan, C.J., E.J. Shpall, and G. Keller, Differential long-term and multilineage engraftment potential from subfractions of human CD34(+) cord blood cells transplanted into NOD/SCID mice, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 99 (1), pp. 413-418, (2002).

126. McKenzie, J.L., O.I. Gan, M. Doedens, J.C.Y. Wang, and J.E. Dick, Individual stem cells with highly variable proliferation and self-renewal properties comprise the human hematopoietic stem cell compartment, Nature Immunology, 7 (11), pp. 1225-1233, (2006).

127. Almassalha, L.M., G.M. Bauer, J.E. Chandler, S. Gladstein, L. Cherkezyan, Y. Stypula-Cyrus, S. Weinberg, D. Zhang, P.T. Ruhoff, H.K. Roy, H. Subramanian, N.S. Chandel, I. Szleifer, and V. Backman, Label-free imaging of the native, living cellular nanoarchitecture using partial-wave spectroscopic microscopy, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 113 (42), pp. E6372-E6381, (2016).

128. Slaughter, D.P., H.W. Southwick, and W. Smejkal, "Field cancerization" in oral stratified squamous epithelium. Clinical implications of multicentric origin, Cancer, 6 (5), pp. 963-968, (1953).

129. Sokolov, I., M.E. Dokukin, V. Kalaparthi, M. Miljkovic, A. Wang, J.D. Seigne, P. Grivas, and E. Demidenko, Noninvasive diagnostic imaging using machine-learning analysis of nanoresolution images of cell surfaces: Detection of bladder cancer, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 115 (51), pp. 12920-12925, (2018).

130. Tsui, I.F.L., C. Garnis, and C.F. Poh, A Dynamic Oral Cancer Field Unraveling the Underlying Biology and Its Clinical Implication, American Journal of Surgical Pathology, 33 (11), pp. 1732-1738, (2009).

131. Kaufman, C.K., C. Mosimann, Z.P. Fan, S. Yang, A.J. Thomas, J. Ablain, J.L. Tan, R.D. Fogley, E. van Rooijen, E.J. Hagedorn, C. Ciarlo, R.M. White, D.A. Matos, A.C. Puller, C. Santoriello, E.C. Liao, R.A. Young, and L.I. Zon, A zebrafish melanoma model reveals emergence of neural crest identity during melanoma initiation, Science, 351 (6272), (2016).

132. Patton, E.E., H.R. Widlund, J.L. Kutok, K.R. Kopani, J.F. Amatruda, R.D. Murphey, S. Berghmans, E.A. Mayhall, D. Traver, C.D.M. Fletcher, J.C. Aster, S.R. Granter, A.T. Look, C. Lee, D.E. Fisher, and L.I. Zon, BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma, Current Biology, 15 (3), pp. 249-254, (2005).

133. Ciarlo, C., C.K. Kaufman, B. Kinikoglu, J. Michel, S. Yang, C. D'Amato, S. Blokzijl-Franke, J. den Hertog, T.M. Schlaeger, Y. Zhou, E. Liao, and L.I. Zon, A chemical screen in zebrafish embryonic cells establishes that Akt activation is required for neural crest development, Elife, 6, (2017).

134. Li, M., L.Q. Liu, X.N. Xu, X.J. Xing, D. Dang, N. Xi, and Y.C. Wang, Nanoscale characterization of dynamic cellular viscoelasticity by atomic force microscopy with varying measurement parameters, Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials, 82, pp. 193-201, (2018).

135. Gothot, A., R. Pyatt, J. McMahel, S. Rice, and E.F. Srour, Functional heterogeneity of human CD34(+) cells isolated in subcompartments of the G(0)/G(1) phase of the cell cycle, Blood, 90 (11), pp. 4384-4393, (1997).

136. Stewart, M.P., Y. Toyoda, A.A. Hyman, and D.J. Muller, Tracking mechanics and volume of globular cells with atomic force microscopy using a constant-height clamp, Nature Protocols, 7 (1), pp. 143-154, (2012).

137. Guz, N.V., S.J. Patel, M.E. Dokukin, B. Clarkson, and I. Sokolov, Biophysical differences between chronic myelogenous leukemic quiescent and proliferating stem/progenitor cells, Nanomedicine, 12 (8), pp. 24292437, (2016).

138. Nawaz, S., P. Sanchez, K. Bodensiek, S. Li, M. Simons, and I.A.T. Schaap,

Cell Visco-Elasticity Measured with AFM and Vertical Optical Trapping

at Sub-Micrometer Deformations, Biophysical Journal, 104 (2), pp. 478a-478a, (2013).

139. Gordon, M.Y., S.B. Marley, J.F. Apperley, D. Marin, J. Kaeda, R. Szydlo, and J.M. Goldman, Clinical heterogeneity in chronic myeloid leukaemia reflecting biological diversity in normal persons, British Journal of Haematology, 122 (3), pp. 424-429, (2003).

140. Hernandez, A., L. Corral, A. Muniz, C. Alaez, E. Espinosa, G. Martinez, and P. Hernandez, Further Evidence for the Molecular Heterogeneity of Chronic Myeloid-Leukemia, Annals of Hematology, 62 (6), pp. 217-220, (1991).

141. Sessions, J., Chronic myeloid leukemia in 2007, Journal of Managed Care Pharmacy, 13 (8), pp. S4-S7, (2007).

142. Gaikwad, R., S. Iyer, N. Guz, D. Volkov, M. Dokukin, I. Sokolov, and C.D. Woodworth, Atomic Force Microscopy Helps to Develop Methods for Physical Detection of Cancerous Cells, Fourth International Conference on Quantum, Nano and Micro Technologies: Icqnm 2010, Proceedings, pp. 18-22, (2010).

143. Kurzrock, R., J.U. Gutterman, and M. Talpaz, The Molecular-Genetics of Philadelphia-Chromosome Positive Leukemias, New England Journal of Medicine, 319 (15), pp. 990-998, (1988).

144. Preisinger, C. and W. Kolch, The Bcr-Abl kinase regulates the actin cytoskeleton via a GADS/Slp-76/Nck1 adaptor protein pathway, Cellular Signalling, 22 (5), pp. 848-856, (2010).

145. Hoekstra, E., L.L. Kodach, A.M. Das, R.R. Ruela-de-Sousa, C.V. Ferreira, J.C. Hardwick, C.J. van der Woude, M.P. Peppelenbosch, T.L.M. ten Hagen, and G.M. Fuhler, Low molecular weight protein tyrosine phosphatase (LMWPTP) upregulation mediates malignant potential in colorectal cancer, Oncotarget, 6 (10), pp. 8300-8312, (2015).

146. Lam, W.A., M.J. Rosenbluth, and D.A. Fletcher, Chemotherapy exposure decreases leukemia cell deformability as determined by atomic force microscopy: Implications for leukostasis in acute leukemia., Blood, 108 (11), pp. 668a-669a, (2006).

147. Lam, W.A., M.J. Rosenbluth, and D.A. Fletcher, Chemotherapy exposure increases leukemia cell stiffness, Blood, 109 (8), pp. 3505-3508, (2007).

148. McCarthy, L.S., N. Smeulders, and D.T. Wilcox, Cell biology of bladder development and the role of the extracellular matrix, Nephron Exp Nephrol, 95 (4), pp. e129-33, (2003).

149. Friedl, P. and E.B. Brocker, The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matrix, Cellular and Molecular Life Sciences, 57 (1), pp. 41-64, (2000).

150. Dozmorov, M.G., K.D. Kyker, P.J. Hauser, R. Saban, D.D. Buethe, I. Dozmorov, M.B. Centola, D.J. Culkin, and R.E. Hurst, From microarray to biology: an integrated experimental, statistical and in silico analysis of

how the extracellular matrix modulates the phenotype of cancer cells, Bmc Bioinformatics, 9, (2008).

151. Heilmann, S., K. Ratnakumar, E. Langdon, E. Kansler, I. Kim, N.R. Campbell, E. Perry, A. McMahon, C. Kaufman, E. van Rooijen, W. Lee, C. Iacobuzio-Donahue, R. Hynes, L. Zon, J. Xavier, and R.M. White, A Quantitative System for Studying Metastasis Using Transparent Zebrafish, Cancer Res, 75 (20), pp. 4272-4282, (2015).

152. A-Hassan, E., W.F. Heinz, M.D. Antonik, N.P. D'Costa, S. Nageswaran, C.A. Schoenenberger, and J.H. Hoh, Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy, Biophysical journal, 74 (3), pp. 1564-1578, (1998).

153. Sokolov, I., G. Zorn, and J.M. Nichols, A study of molecular adsorption of a cationic surfactant on complex surfaces with atomic force microscopy, Analyst, 141 (3), pp. 1017-1026, (2016).

154. Dokukin, M.E., N.V. Guz, R.M. Gaikwad, C.D. Woodworth, and I. Sokolov, Cell surface as a fractal: normal and cancerous cervical cells demonstrate different fractal behavior of surface adhesion maps at the nanoscale, Physical Review Letters, 107 (2), pp. 028101, (2011).

155. Dokukin, M.E., N.V. Guz, C.D. Woodworth, and I. Sokolov, Emerging of fractal geometry on surface of human cervical epithelial cells during progression towards cancer, New Journal of Physics, 17, pp. 033019 (2015).

156. Guz, N.V., M.E. Dokukin, C.D. Woodworth, A. Cardin, and I. Sokolov,

Towards early detection of cervical cancer: Fractal dimension of AFM images of human cervical epithelial cells at different stages ofprogression to cancer, Nanomedicine, 11 (7), pp. 1667-75, (2015).

157. Sokolov, I., Fractals: a possible new path to diagnose and cure cancer?, Future Oncology, 11 (22), pp. 3049-3051, (2015).

158. Ketene, A.N., E.M. Schmelz, P.C. Roberts, and M. Agah, The effects of cancer progression on the viscoelasticity of ovarian cell cytoskeleton structures, Nanomedicine-Nanotechnology Biology and Medicine, 8 (1), pp. 93-102, (2012).

159. Rebelo, L.M., J.S. de Sousa, J. Mendes, and M. Radmacher, Comparison of the viscoelastic properties of cells from different kidney cancer phenotypes measured with atomic force microscopy, Nanotechnology, 24 (5), (2013).

160. Wu, H.W., T. Kuhn, and V.T. Moy, Mechanical properties of l929 cells measured by atomic force microscopy: Effects of anticytoskeletal drugs and membrane crosslinking, Scanning, 20 (5), pp. 389-397, (1998).

161. Ikai, A., A Review on: Atomic Force Microscopy Applied to Nano-mechanics of the Cell, Nano/Micro Biotechnology, 119, pp. 47-61, (2010).

162. Alessandrini, A. and P. Facci, AFM: a versatile tool in biophysics, Measurement Science & Technology, 16 (6), pp. R65-R92, (2005).

163. Radmacher, M., Studying the mechanics of cellular processes by atomic force microscopy, Cell Mechanics, 83, pp. 347-372, (2007).

164. Costa, K.D., Imaging and Probing Cell Mechanical Properties With the Atomic Force Microscope, in Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols, D.J. Taatjes and B.T. Mossman, Editors. 2006, Humana Press: Totowa, NJ. p. 331-361.

165. Yang, I.H., C.C. Co, and C.C. Ho, Alteration of human neuroblastoma cell morphology and neurite extension with micropatterns, Biomaterials, 26 (33), pp. 6599-6609, (2005).

166. Deng, X.Y., F. Xiong, X.Y. Li, B. Xiang, Z. Li, X. Wu, C. Guo, X.L. Li, Y. Li, G.Y. Li, W. Xiong, and Z.Y. Zeng, Application of atomic force microscopy in cancer research, Journal of Nanobiotechnology, 16, (2018).

167. Jembrek, M.J., G. Simic, P.R. Hof, and S. Segota, Atomic Force Microscopy as an Advanced Tool in Neuroscience, Translational Neuroscience, 6 (1), pp. 117-130, (2015).

168. Guz, N.V., S.J. Patel, M.E. Dokukin, B. Clarkson, and I. Sokolov, AFM study shows prominent physical changes in elasticity and pericellular layer in human acute leukemic cells due to inadequate cell-cell communication, Nanotechnology, 27 (49), (2016).

169. Grubisic, G., P. Klaric, L. Jokanovic, H.S. Vranes, I. Grbavac, and I. Bolanca, Diagnostic Approach for Precancerous and Early Invasive Cancerous Lesions of the Uterine Cervix, Collegium Antropologicum, 33 (4), pp. 1431-1436, (2009).

170. Costa, S., G. Negri, M. Sideri, D. Santini, G. Martinelli, S. Venturoli, C. Pelusi, S. Syrjanen, K. Syrjanen, and G. Pelusi, Human papillomavirus (HPV) test and PAP smear as predictors of outcome in conservatively treated adenocarcinoma in situ (AIS) of the uterine cervix, Gynecologic Oncology, 106 (1), pp. 170-176, (2007).

171. Costa, S., M. Sideri, G. Negri, S. Venturoli, D. Santini, C. Casadio, M.T. Sandri, and L. Bucchi, The predictive value of human papillomavirus testing for the outcome of patients conservatively treated for stage IA squamous cell cervical carcinoma, Journal of Clinical Virology, 70, pp. 5357, (2015).

172. Hanley, K.Z., T.S. Tadros, A.J. Briones, G.G. Birdsong, and M.B. Mosunjac, Hematologic Malignancies of the Female Genital Tract Diagnosed on Liquid-Based Pap Test: Cytomorphologic Features and Review of Differential Diagnoses, Diagnostic Cytopathology, 37 (1), pp. 61-67, (2009).

173. Hoda, R.S., C. Colello, M. Roddy, and P.M. Houser, "Fruiting body" of Aspergillus species in a routine cervico-vaginal smear (Pap test), Diagnostic Cytopathology, 33 (4), pp. 244-245, (2005).

174. Smith, R.A., V. Cokkinides, A.C. Von Eschenbach, B. Levin, C. Cohen, C.D. Runowicz, S. Sener, D. Saslow, and J. Eyre, American cancer society

guidelines for the early detection of cancer, Journal of Urology, 168 (1), pp. 372-373, (2002).

175. Benoit, A.G., G.V. Krepart, and R.J. Lotocki, Results of Prior Cytologic Screening in Patients with a Diagnosis of Stage-I Carcinoma of the Cervix, American Journal of Obstetrics and Gynecology, 148 (5), pp. 690-694, (1984).

176. Soost, H.J., H.J. Lange, W. Lehmacher, and B. Ruffingkullmann, The Validation of Cervical Cytology - Sensitivity, Specificity and Predictive Values, Acta Cytologica, 35 (1), pp. 8-14, (1991).

177. Nanda, K., D.C. McCrory, E.R. Myers, L.A. Bastian, V. Hasselblad, J.D. Hickey, and D.B. Matchar, Accuracy of the Papanicolaou test in screening for andfollow-up of cervical cytologic abnormalities: A systematic review, Annals of Internal Medicine, 132 (10), pp. 810-819, (2000).

178. Iyer, K.S., R.M. Gaikwad, C.D. Woodworth, D.O. Volkov, and I. Sokolov, Physical Labeling of Papillomavirus-Infected, Immortal, and Cancerous Cervical Epithelial Cells Reveal Surface Changes at Immortal Stage, Cell Biochemistry and Biophysics, 63 (2), pp. 109-116, (2012).

179. Sunyer, R., F. Ritort, R. Farre, and D. Navajas, Thermal activation and ATP dependence of the cytoskeleton remodeling dynamics, Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys, 79 (5 Pt 1), pp. 051920, (2009).

180. Sedivy, R. and R.M. Mader, Fractals, chaos, and cancer: Do they coincide?, Cancer Investigation, 15 (6), pp. 601-607, (1997).

181. Baish, J.W. and R.K. Jain, Fractals and cancer, Cancer Research, 60 (14), pp. 3683-3688, (2000).

182. Pansera, F., Fractals and Cancer, Medical Hypotheses, 42 (6), pp. 400-400, (1994).

183. Mandelbrot, B.B., The fractal geometry of nature. 3 ed. 1983, New York: W. H. Freeman and Comp.

184. Mandelbrot, B.B., Multifractals and Fractals, Physics Today, 39 (9), pp. 11-&, (1986).

185. Meakin, P., Fractals, Scaling and Growth Far from Equilibrium. 1997.

186. Palmore, J.I., Chaos, Dynamics and Fractals: An Algorithmic Approach to Deterministic Chaos (J. L. McCauley), SIAM Rev., 36, pp. 515-517, (1994).

187. Wu, K.K.S., O. Lahav, and M.J. Rees, The large-scale smoothness of the Universe, Nature, 397 (6716), pp. 225-230, (1999).

188. Losa, G.A., Fractals in biology and medicine. Volume. Mathematics and biosciences in interaction. Vol. IV. 2005, Basel ; Boston: Birkhauser.

189. Lieberman-Aiden, E., N.L. van Berkum, L. Williams, M. Imakaev, T. Ragoczy, A. Telling, I. Amit, B.R. Lajoie, P.J. Sabo, M.O. Dorschner, R. Sandstrom, B. Bernstein, M.A. Bender, M. Groudine, A. Gnirke, J. Stamatoyannopoulos, L.A. Mirny, E.S. Lander, and J. Dekker, Comprehensive Mapping of Long-Range Interactions Reveals Folding

Principles of the Human Genome, Science, 326 (5950), pp. 289-293, (2009).

190. Less, J.R., T.C. Skalak, E.M. Sevick, and R.K. Jain, Microvascular Architecture in a Mammary-Carcinoma - Branching Patterns and Vessel Dimensions, Cancer Research, 51 (1), pp. 265-273, (1991).

191. Mashiah, A., O. Wolach, J. Sandbank, O. Uziel, P. Raanani, and M. Lahav, Lymphoma and leukemia cells possess fractal dimensions that correlate with their biological features, Acta Haematologica, 119 (3), pp. 142-150, (2008).

192. Sedivy, R., C. Windischberger, K. Svozil, E. Moser, and G. Breitenecker,

Fractal analysis: An objective method for identifying atypical nuclei in dysplastic lesions of the cervix uteri, Gynecologic Oncology, 75 (1), pp. 7883, (1999).

193. Doornewaard, H., Y.T. van der Schouw, Y. van der Graaf, A.B. Bos, and J.G. van den Tweel, Observer variation in cytologic grading for cervical dysplasia of Papanicolaou smears with the PAPNET Testing System, Cancer Cytopathology, 87 (4), pp. 178-183, (1999).

194. Pierard, G.E., N. Ezzine-Sebai, B. Fazaa, N. Nikkels-Tassoudji, and C. Pierard-Franchimont, Karyometry of malignant melanoma cells present in skin strippings, Skin Research and Technology, 1, pp. 177-179, (1995).

195. Wax, A., C. Yang, M.G. Muller, R. Nines, C.W. Boone, V.E. Steele, G.D. Stoner, R.R. Dasari, and M.S. Feld, In situ detection of neoplastic transformation and chemopreventive effects in rat esophagus epithelium using angle-resolved low-coherence interferometry, Cancer Res, 63 (13), pp. 3556-9, (2003).

196. Woodworth, C.D., P.E. Bowden, J. Doniger, L. Pirisi, W. Barnes, W.D. Lancaster, and J.A. Dipaolo, Characterization of Normal Human Exocervical Epithelial-Cells ImmortalizedInvitro by Papillomavirus Type-16 and Type-18 DNA, Cancer Research, 48 (16), pp. 4620-4628, (1988).

197. Falconer, K.J., Fractal geometry : mathematical foundations and applications. 1990, Chichester ; New York: Wiley. xxii, 288 p.

198. Kant, R., Statistics of approximately self-affine fractals: Random corrugated surface and time series, Physical Review E, 53 (6), pp. 57495763, (1996).

199. Barabasi, A.L. and T. Vicsek, Multifractality of self-affine fractals, Physical Review A, 44 (4), pp. 2730-2733, (1991).

200. Fisher, T.E., P.E. Marszalek, and J.M. Fernandez, Stretching single molecules into novel conformations using the atomic force microscope, Nat Struct Biol, 7 (9), pp. 719-24, (2000).

201. Kohonen, M.M. and H.K. Christenson, Capillary condensation of water between rinsed mica surfaces, Langmuir, 16 (18), pp. 7285-7288, (2000).

202. Gregoire, L., R. Rabah, E.M. Schmelz, A. Munkarah, P.C. Roberts, and W.D. Lancaster, Spontaneous malignant transformation of human ovarian surface epithelial cells in vitro, Clin Cancer Res, 7 (12), pp. 4280-7, (2001).

203. Woodworth, C.D., S. Waggoner, W. Barnes, M.H. Stoler, and J.A. DiPaolo, Human cervical and foreskin epithelial cells immortalized by human papillomavirus DNAs exhibit dysplastic differentiation in vivo, Cancer Res, 50 (12), pp. 3709-15, (1990).

204. Pugacheva, E.N., S.A. Jablonski, T.R. Hartman, E.P. Henske, and E.A. Golemis, HEF1-Dependent aurora a activation induces disassembly of the primary cilium, Cell, 129 (7), pp. 1351-1363, (2007).

205. Toole, B., Glycosaminoglycans in morphogenesis, in Cell Biology of the Extracellular Matrix, E. Hay, Editor. 1982, Plenum Press: New York. p. 259-294.

206. Tranchida, D., S. Piccarolo, J. Loos, and A. Alexeev, Mechanical characterization of polymers on a nanometer scale through nanoindentation. A study on pile-up and viscoelasticity, Macromolecules, 40 (4), pp. 1259-1267, (2007).

207. Tranchida, D., Z. Kiflie, S. Acierno, and S. Piccarolo, Nanoscale mechanical characterization of polymers by atomic force microscopy (AFM) nanoindentations: viscoelastic characterization of a model material, Measurement Science & Technology, 20 (9), pp. 095702, (2009).

208. Stan, G., S.D. Solares, B. Pittenger, N. Erina, and C.M. Su, Nanoscale mechanics by tomographic contact resonance atomic force microscopy, Nanoscale, 6 (2), pp. 962-969, (2014).

209. Pittenger, B., N. Erina, and C. Su. Quantitative Mechanical Property Mapping at the Nanoscale with PeakForce QNM. 2010; Available from: https://www.bruker.com/fileadmin/user upload/8-PDF-Docs/SurfaceAnalysis/AFM/ApplicationNotes/AN128-RevB0-Quantitative Mechanical Property Mapping at the Nanoscale with Pe akForceQNM-AppNote.pdf.

210. Kodera, N., D. Yamamoto, R. Ishikawa, and T. Ando, Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy, Nature, 468 (7320), pp. 72-+, (2010).

211. Giesbers, A.J.M., U. Zeitler, S. Neubeck, F. Freitag, K.S. Novoselov, and J.C. Maan, Nanolithography and manipulation of graphene using an atomic force microscope, Solid State Communications, 147 (9-10), pp. 366369, (2008).

212. Moores, B., J. Simons, S. Xu, and Z. Leonenko, AFM-assistedfabrication of thiol SAM pattern with alternating quantified surface potential, Nanoscale Research Letters, 6, (2011).

213. Tranchida, D. and S. Piccarolo, Determining structure distribution in inhomogenous samples on the nanometer scale by atomic force

microscopy, 10th ESAFORM Conference on Material Forming, Pts A and B, 907, pp. 847-852, (2007).

214. Reed, J., B. Mishra, B. Pittenger, S. Magonov, J. Troke, M.A. Teitell, and J.K. Gimzewski, Single molecule transcription profiling with AFM, Nanotechnology, 18 (4), pp. -, (2007).

215. Sokolov, I.Y., M. Firtel, and G.S. Henderson, In situ high-resolution atomic force microscope imaging of biological surfaces, Journal of Vacuum Science & Technology a-Vacuum Surfaces and Films, 14 (3), pp. 674-678, (1996).

216. Zhong, Q., D. Inniss, K. Kjoller, and V.B. Elings, Fractured Polymer Silica Fiber Surface Studied by Tapping Mode Atomic-Force Microscopy, Surface Science, 290 (1-2), pp. L688-L692, (1993).

217. Garcia, R. and E.T. Herruzo, The emergence of multifrequency force microscopy, Nature Nanotechnology, 7 (4), pp. 217-226, (2012).

218. Instruments, A.R.O. Fast Force Mapping Mode. 2020; Available from: https://afm.oxinst.com/products/cypher-nanomechanical-accessories/cypher-fast-force-mapping-mode.

219. NT-MDT. NT-MDT Spectrum Instruments. 2020; Available from: https : //www.ntmdt-si.com/products.

220. Sahin, O., S. Magonov, C. Su, C.F. Quate, and O. Solgaard, An atomic force microscope tip designed to measure time-varying nanomechanical forces, Nature Nanotechnology, 2, pp. 507 - 514, (2007).

221. Gonzalez-Dominguez, I., S. Gutierrez-Granados, L. Cervera, F. Godia, and N. Domingo, Identification of HIV-1-Based Virus-like Particles by Multifrequency Atomic Force Microscopy, Biophys J, 111 (6), pp. 11731179, (2016).

222. Smolyakov, G., C. Formosa-Dague, C. Severac, R.E. Duval, and E. Dague,

High speed indentation measures by FV, QI and QNM introduce a new understanding of bionanomechanical experiments, Micron, 85, pp. 8-14, (2016).

223. Sokolov, I.Y., On the limits on spectroscopic ability of afm and interaction between an afm tip and a sample Surface Science, 311, pp. 287-294, (1994).

224. Kalinin, S.V., E. Strelcov, A. Belianinov, S. Somnath, R.K. Vasudevan, E.J. Lingerfelt, R.K. Archibald, C.M. Chen, R. Proksch, N. Laanait, and S.

Jesse, Big, Deep, and Smart Data in Scanning Probe Microscopy, Acs Nano, 10 (10), pp. 9068-9086, (2016).

225. Guz, N.V., R.M. Gaikwad, M.E. Dokukin, and I. Sokolov, A novel in vitro stripping method to study geometry of corneocytes with fluorescent microscopy: example of aging skin, Skin Research and Technology, 15 (4), pp. 379-383, (2009).

226

227

228

229

230

231

232

233

234

235

236

237

238

239

Levy, R. and M. Maaloum, Measuring the spring constant of atomic force microscope cantilevers: thermal fluctuations and other methods, Nanotechnology, 13 (1), pp. 33-37, (2002).

Paszek, M.J., C.C. DuFort, O. Rossier, R. Bainer, J.K. Mouw, K. Godula, J.E. Hudak, J.N. Lakins, A.C. Wijekoon, L. Cassereau, M.G. Rubashkin, M.J. Magbanua, K.S. Thorn, M.W. Davidson, H.S. Rugo, J.W. Park, D.A. Hammer, G. Giannone, C.R. Bertozzi, and V.M. Weaver, The cancer glycocalyx mechanically primes integrin-mediated growth and survival, Nature, 511 (7509), pp. 319-+, (2014).

Carbone, C.B., R.D. Vale, and N. Stuurman, An acquisition and analysis pipeline for scanning angle interference microscopy, Nature Methods, 13 (11), pp. 897-898, (2016).

Butt, H.J. and M. Kappl, Normal capillary forces, Advances in Colloid and Interface Science, 146 (1-2), pp. 48-60, (2009).

Pitois, O., P. Moucheront, and X. Chateau, Rupture energy of a pendular liquid bridge, European Physical Journal B, 23 (1), pp. 79-86, (2001). Pitois, O., P. Moucheront, and X. Chateau, Liquid bridge between two moving spheres: An experimental study of viscosity effects, Journal of Colloid and Interface Science, 231 (1), pp. 26-31, (2000). Rabinovich, Y.I., M.S. Esayanur, and B.M. Moudgil, Capillary forces between two spheres with a fixed volume liquid bridge: Theory and experiment, Langmuir, 21 (24), pp. 10992-10997, (2005). Rief, M., F. Oesterhelt, B. Heymann, and H.E. Gaub, Single molecule force spectroscopy on polysaccharides by atomic force microscopy, Science, 275 (5304), pp. 1295-1297, (1997).

Hinterdorfer, P. and Y.F. Dufrene, Detection and localization of single molecular recognition events using atomic force microscopy, Nature Methods, 3 (5), pp. 347-355, (2006).

Esteva, A., B. Kuprel, R.A. Novoa, J. Ko, S.M. Swetter, H.M. Blau, and S.

Thrun, Dermatologist-level classification of skin cancer with deep neural

networks, Nature, 542 (7639), pp. 115-118, (2017).

Weichert, J., A. Welp, J.L. Scharf, C. Dracopoulos, W.H. Becker, and M.

Gembicki, The Use of Artificial Intelligence in Automation in the Fields of

Gynaecology and Obstetrics - an Assessment of the State of Play,

Geburtshilfe Frauenheilkd, 81 (11), pp. 1203-1216, (2021).

Komura, D. and S. Ishikawa, Machine learning approaches for pathologic

diagnosis, Virchows Arch, 475 (2), pp. 131-138, (2019).

Sokolov, I. and M.E. Dokukin, Imaging of Soft and Biological Samples

Using AFM Ringing Mode, Nanoscale Imaging: Methods and Protocols,

1814, pp. 469-482, (2018).

Dokukin, M.E. and I. Sokolov, Nanoscale compositional mapping of cells, tissues, and polymers with ringing mode of atomic force microscopy, Scientific Reports, 7, pp. 11828, (2017).

240. Makarova, N., B. Peng, S. Peerzade, M.E. Dokukin, and I. Sokolov, Imaging of Molecular Coating on Nanoparticle Surface Using AFM Ringing Mode, Microscopy and Microanalysis, 26, pp. 3136-3138, (2020).

241. McGee, A.M., D.L. Douglas, Y. Liang, S.M. Hyder, and C.P. Baines, The mitochondrial protein Clqbp promotes cell proliferation, migration and resistance to cell death, Cell Cycle, 10 (23), pp. 4119-27, (2011).

242. Damania, D., H. Subramanian, A.K. Tiwari, Y. Stypula, D. Kunte, P. Pradhan, H.K. Roy, and V. Backman, Role of cytoskeleton in controlling the disorder strength of cellular nanoscale architecture, Biophys J, 99 (3), pp. 989-96, (2010).

243. Cohen, J.D., L. Li, Y. Wang, C. Thoburn, B. Afsari, L. Danilova, C. Douville, A.A. Javed, F. Wong, A. Mattox, R.H. Hruban, C.L. Wolfgang, M.G. Goggins, M. Dal Molin, T.L. Wang, R. Roden, A.P. Klein, J. Ptak, L. Dobbyn, J. Schaefer, N. Silliman, M. Popoli, J.T. Vogelstein, J.D. Browne, R.E. Schoen, R.E. Brand, J. Tie, P. Gibbs, H.L. Wong, A.S. Mansfield, J. Jen, S.M. Hanash, M. Falconi, P.J. Allen, S. Zhou, C. Bettegowda, L.A. Diaz, Jr., C. Tomasetti, K.W. Kinzler, B. Vogelstein, A.M. Lennon, and N. Papadopoulos, Detection and localization of surgically resectable cancers with a multi-analyte blood test, Science, 359 (6378), pp. 926-930, (2018).

244. American Cancer Society. Key statistics for bladder cancer. 2022; Available from: https://www.cancer.org/cancer/bladder-cancer/about/key-statistics.html.

245. Grossman, H.B., E. Messing, M. Soloway, K. Tomera, G. Katz, Y. Berger, and Y. Shen, Detection of bladder cancer using a point-of-care proteomic assay, Jama, 293 (7), pp. 810-6, (2005).

246. Yeung, C., T. Dinh, and J. Lee, The health economics of bladder cancer: an updated review of the published literature, Pharmacoeconomics, 32 (11), pp. 1093-104, (2014).

247. Isfoss, B.L., The sensitivity offluorescent-light cystoscopy for the detection of carcinoma in situ (CIS) of the bladder: a meta-analysis with comments on gold standard, BJU international, 108 (11), pp. 1703-7, (2011).

248. Burger, M., J.W.F. Catto, G. Dalbagni, H.B. Grossman, H. Herr, P. Karakiewicz, W. Kassouf, L.A. Kiemeney, C. La Vecchia, S. Shariat, and Y. Lotan, Epidemiology and risk factors of urothelial bladder cancer, European urology, 63 (2), pp. 234-41, (2013).

249. Ludecke, G., A. Pilatz, A. Hauptmann, T. Bschleipfer, and W. Weidner, Comparative analysis of sensitivity to blood in the urine for urine-based point-of-care assays (UBC rapid, NMP22 BladderChek and BTA-stat) in primary diagnosis of bladder carcinoma. Interference of blood on the results of urine-based POC tests, Anticancer research, 32 (5), pp. 2015-8, (2012).

250. Koss, L.G., D. Deitch, R. Ramanathan, and A.B. Sherman, Diagnostic value of cytology of voided urine, Acta Cytol, 29 (5), pp. 810-6, (1985).

251. Raitanen, M.-P., R. Aine, E. Rintala, J. Kallio, P. Rajala, H. Juusela, T.L.J. Tammela, and G. FinnBladder, Differences between local and review urinary cytology in diagnosis of bladder cancer. An interobserver multicenter analysis, European urology, 41 (3), pp. 284-9, (2002).

252. Reid, M.D., A.O. Osunkoya, M.T. Siddiqui, and S.W. Looney, Accuracy of grading of urothelial carcinoma on urine cytology: an analysis of interobserver and intraobserver agreement, Int J Clin Exp Pathol, 5 (9), pp. 882-91, (2012).

253. Karakiewicz, P.I., S. Benayoun, C. Zippe, G. Ludecke, H. Boman, M. Sanchez-Carbayo, R. Casella, C. Mian, M.G. Friedrich, S. Eissa, H. Akaza, H. Huland, H. Hedelin, R. Rupesh, N. Miyanaga, A.I. Sagalowsky, M.J. Marberger, and S.F. Shariat, Institutional variability in the accuracy of urinary cytology for predicting recurrence of transitional cell carcinoma of the bladder, BJU Int, 97 (5), pp. 997-1001, (2006).

254. Talwar, R., T. Sinha, S.C. Karan, D. Doddamani, A. Sandhu, G.S. Sethi, A. Srivastava, V. Narang, A. Agarwal, and N. Adhlakha, Voided urinary cytology in bladder cancer: is it time to review the indications?, Urology, 70 (2), pp. 267-71, (2007).

255. Mbeutcha, A., I. Lucca, R. Mathieu, Y. Lotan, and S.F. Shariat, Current Status of Urinary Biomarkers for Detection and Surveillance of Bladder Cancer, The Urologic clinics of North America, 43 (1), pp. 47-62, (2016).

256. Mungan, N.A., S. Kulacoglu, M. Basar, M. Sahin, and J.A. Witjes, Can sensitivity of voided urinary cytology or bladder wash cytology be improved by the use of different urinary portions?, Urologia internationalis, 62 (4), pp. 209-12, (1999).

257. Chandler, J.E., Y. Stypula-Cyrus, L. Almassalha, G. Bauer, L. Bowen, H. Subramanian, I. Szleifer, and V. Backman, Colocalization of cellular nanostructure using confocal fluorescence and partial wave spectroscopy, J Biophotonics, 10 (3), pp. 377-384, (2017).

258. Li, S., L. Li, Q. Zeng, Y. Zhang, Z. Guo, Z. Liu, M. Jin, C. Su, L. Lin, J. Xu, and S. Liu, Characterization and noninvasive diagnosis of bladder cancer with serum surface enhanced Raman spectroscopy and genetic algorithms, Sci Rep, 5, pp. 9582, (2015).

259. Kita, K., K. Asanuma, T. Okamoto, E. Kawamoto, K. Nakamura, T. Hagi, T. Nakamura, M. Shimaoka, and A. Sudo, Cytoskeletal Actin Structure in Osteosarcoma Cells Determines Metastatic Phenotype via Regulating Cell Stiffness, Migration, and Transmigration, Curr Issues Mol Biol, 43 (3), pp. 1255-1266, (2021).

260. Dokukin, M.E., N.V. Guz, and I. Sokolov, Mechanical properties of cancer cells depend on number ofpassages: Atomic force microscopy indentation study, Japanese Journal of Applied Physics, 56 (8), (2017).

261

262

263

264

265

266

267

268

269

270

271

272

273

274

Sokolov, I. and M.E. Dokukin, Fractal Analysis of Cancer Cell Surface, Cancer Nanotechnology: Methods and Protocols, 1530, pp. 229-245, (2017).

VandenBussche, C.J., D.L. Rosenthal, and M.T. Olson, Adequacy in voided urine cytology specimens: The role of volume and a repeat void upon predictive values for high-grade urothelial carcinoma, Cancer Cytopathol, 124 (3), pp. 174-80, (2016).

Rengifo-Cam, W., A. Konishi, N. Morishita, H. Matsuoka, T. Yamori, S. Nada, and M. Okada, Csk defines the ability of integrin-mediated cell adhesion and migration in human colon cancer cells: implication for a potential role in cancer metastasis, Oncogene, 23 (1), pp. 289-97, (2004). Kunte, D.P., R.K. Wali, J.L. Koetsier, J. Hart, M.N. Kostjukova, A.Y. Kilimnik, I.G. Pyatkin, S.R. Strelnikova, and H.K. Roy, Down-regulation of the tumor suppressor gene C-terminal Src kinase: an early event during premalignant colonic epithelial hyperproliferation, FEBS Lett, 579 (17), pp. 3497-502, (2005).

Breiman, L., Random forests, Machine Learning, 45 (1), pp. 5-32, (2001). Geurts, P., D. Ernst, and L. Wehenkel, Extremely randomized trees, Machine Learning, 63 (1), pp. 3-42, (2006).

Friedman, J.H., Stochastic gradient boosting, Computational Statistics & Data Analysis, 38 (4), pp. 367-378, (2002).

Sariyar, M., A. Borg, and K. Pommerening, Active learning strategies for the deduplication of electronic patient data using classification trees, J Biomed Inform, 45 (5), pp. 893-900, (2012).

Azer, S.A. and A.G. Frauman, Seeing the wood for the trees: approaches to teaching and assessing clinical pharmacology and therapeutics in a problem-based learning course, Ann Acad Med Singapore, 37 (3), pp. 2049, (2008).

Dunn-Walters, D.K., H. Edelman, and R. Mehr, Immune system learning and memory quantified by graphical analysis of B-lymphocytephylogenetic trees, Biosystems, 76 (1-3), pp. 141-55, (2004).

Kokol, P., M. Zorman, M.M. Stiglic, and I. Maleiae, The limitations of decision trees and automatic learning in real world medical decision making, Stud Health Technol Inform, 52 Pt 1, pp. 529-33, (1998). Zorman, M., M.M. Stiglic, P. Kokol, and I. Malcic, The limitations of decision trees and automatic learning in real world medical decision making, J Med Syst, 21 (6), pp. 403-15, (1997).

Zavrsnik, J., P. Kokol, I. Maleiae, K. Kancler, M. Mernik, and M. Bigec, ROSE: decision trees, automatic learning and their applications in cardiac medicine, Medinfo, 8 Pt 2, pp. 1688, (1995).

Kokol, P., M. Mernik, J. Zavrsnik, K. Kancler, and I. Malcic, Decision trees based on automatic learning and their use in cardiology, J Med Syst, 18 (4), pp. 201-6, (1994).

275. Wolf, F.M., Problem-based learning and meta-analysis: can we see the forest through the trees?, Acad Med, 68 (7), pp. 542-4, (1993).

276. Harrell, F.E., Jr., K.L. Lee, R.M. Califf, D.B. Pryor, and R.A. Rosati, Regression modelling strategies for improved prognostic prediction, Stat Med, 3 (2), pp. 143-52, (1984).

277. Metropolis, N. and S. Ulam, The Monte Carlo method, J Am Stat Assoc, 44 (247), pp. 335-41, (1949).

278. McMurray, B. and G. Hollich, Core computational principles of language acquisition: can statistical learning do the job? Introduction to special section, Dev Sci, 12 (3), pp. 365-8, (2009).

279. Kleinberg, E.M., An overtraining-resistant stochastic modeling methodfor pattern recognition, Annals of Statistics, 24 (6), pp. 2319-2349, (1996).

280. Cheung, G., A. Sahai, M. Billia, P. Dasgupta, and M.S. Khan, Recent advances in the diagnosis and treatment of bladder cancer, BMC Med, 11, pp. 13, (2013).

281. Chen, Y., L. Liu, Z. Guo, Y. Wang, Y. Yang, and X. Liu, Lost expression of cell adhesion molecule 1 is associated with bladder cancer progression and recurrence and its overexpression inhibited tumor cell malignant behaviors, Oncol Lett, 17 (2), pp. 2047-2056, (2019).

282. Roy, H.K., Y. Liu, R.K. Wali, Y.L. Kim, A.K. Kromine, M.J. Goldberg, and V. Backman, Four-dimensional elastic light-scattering fingerprints as preneoplastic markers in the rat model of colon carcinogenesis, Gastroenterology, 126 (4), pp. 1071-81; discussion 948, (2004).

283. Braakhuis, B.J., M.P. Tabor, J.A. Kummer, C.R. Leemans, and R.H. Brakenhoff, A genetic explanation of Slaughter's concept of field cancerization: evidence and clinical implications, Cancer Res, 63 (8), pp. 1727-30, (2003).

284. Majewski, T., S. Lee, J. Jeong, D.-S. Yoon, A. Kram, M.-S. Kim, T. Tuziak, J. Bondaruk, S. Lee, W.-S. Park, K.S. Tang, W. Chung, L. Shen, S.S. Ahmed, D.A. Johnston, H.B. Grossman, C.P. Dinney, J.-H. Zhou, R.A. Harris, C. Snyder, S. Filipek, S.A. Narod, P. Watson, H.T. Lynch, A. Gazdar, M. Bar-Eli, X.F. Wu, D.J. McConkey, K. Baggerly, J.-P. Issa, W.F. Benedict, S.E. Scherer, and B. Czerniak, Understanding the development of human bladder cancer by using a whole-organ genomic mapping strategy, Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology, 88 (7), pp. 694-721, (2008).

285. Anzai, Y.i., Pattern recognition and machine learning. 1992, Boston: Academic Press. xvi, 407 p.

286. Rasmussen, C.E. and C.K.I. Williams, Gaussian processes for machine learning. Adaptive computation and machine learning. 2006, Cambridge, Mass.: MIT Press. xviii, 248 p.

287. Williams, C.K.I. and D. Barber, Bayesian classification with Gaussian processes, Ieee Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence, 20 (12), pp. 1342-1351, (1998).

288. Kim, S.O., J. Kim, T. Okajima, and N.J. Cho, Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy, Nano Converg, 4 (1), pp. 5, (2017).

289. Gosnell, M.E., D.M. Polikarpov, E.M. Goldys, A.V. Zvyagin, and D.A. Gillatt, Computer-assisted cystoscopy diagnosis of bladder cancer, Urol Oncol, 36 (1), pp. 8 e9-8 e15, (2018).

290. Ye, Z., J. Hu, X. Song, F. Li, X. Zhao, S. Chen, X. Wang, D. He, J. Fan, D. Ye, J. Xing, T. Pan, and D. Wang, A comparison of NBIand WLI cystoscopy in detecting non-muscle-invasive bladder cancer: A prospective, randomized and multi-center study, Sci Rep, 5, pp. 10905, (2015).

291. Lavery, H.J., B. Zaharieva, A. McFaddin, N. Heerema, and K.S. Pohar, A prospective comparison of UroVysion FISH and urine cytology in bladder cancer detection, BMC Cancer, 17 (1), pp. 247, (2017).

292. Mallory, X.F., M. Edrisi, N. Navin, and L. Nakhleh, Assessing the performance of methods for copy number aberration detection from single-cell DNA sequencing data, PLoS Comput Biol, 16 (7), pp. e1008012, (2020).

293. Xu, X., Q. Zhang, J. Song, Q. Ruan, W. Ruan, Y. Chen, J. Yang, X. Zhang, Y. Song, Z. Zhu, and C. Yang, A Highly Sensitive, Accurate, and Automated Single-Cell RNA Sequencing Platform with Digital Microfluidics, Anal Chem, 92 (12), pp. 8599-8606, (2020).

294. Zhao, X., S. Wu, N. Fang, X. Sun, and J. Fan, Evaluation of single-cell classifiers for single-cell RNA sequencing data sets, Brief Bioinform, 21 (5), pp. 1581-1595, (2020).

295. Ziegenhain, C., B. Vieth, S. Parekh, B. Reinius, A. Guillaumet-Adkins, M. Smets, H. Leonhardt, H. Heyn, I. Hellmann, and W. Enard, Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods, Mol Cell, 65 (4), pp. 631-643 e4, (2017).

296. Esserman, L.J., I.M. Thompson, B. Reid, P. Nelson, D.F. Ransohoff, H.G. Welch, S. Hwang, D.A. Berry, K.W. Kinzler, W.C. Black, M. Bissell, H. Parnes, and S. Srivastava, Addressing overdiagnosis and overtreatment in cancer: a prescription for change, Lancet Oncol, 15 (6), pp. e234-42, (2014).

ПРИЛОЖЕНИЕ

Тип Random forest Extremely Randomized Forest Gradient Boosting Trees

данных AUC/ Точность Чувств/спец AUC/ Точность Чувств/спец AUC/ Точность Чувств/спец

N=1 height 75/73 50/84 76/69 77/74 53/84 77/70 74/73 46/86 75/68

M=1 adh. 88/83 68/90 84/77 88/83 69/90 85/78 87/82 69/89 84/77

N=2 height 75/77 40/91 76/69 77/78 44/91 77/71 75/77 40/92 75/69

M=1 adh. 89/87 71/93 86/80 89/86 70/93 87/80 89/87 71/93 86/80

N=2 height 77/78 43/92 76/69 78/79 48/91 78/71 75/78 38/93 74/68

M=2 adh. 89/86 69/93 86/80 90/87 70/94 86/79 89/87 69/94 85/79

N=3 height 73/81 34/95 75/66 74/81 35/95 76/67 73/81 35/95 74/66

M=1 adh. 90/89 70/95 88/81 89/88 69/94 86/79 89/90 70/96 87/80

N=3 height 75/82 36/95 75/68 78/82 42/94 77/69 73/81 34/96 73/66

M=2 adh. 91/90 73/96 87/80 90/90 72/96 87/80 89/90 69/96 85/78

N=3 height 75/82 37/95 76/67 78/83 42/95 77/69 72/81 32/96 73/66

M=3 adh. 90/90 71/96 87/80 90/90 70/96 87/79 88/89 65/96 85/77

N=4 height 69/84 31/97 71/61 70/84 33/97 73/64 69/84 34/97 73/64

M=1 adh. 89/91 75/95 88/80 88/90 71/96 87/79 90/92 74/96 88/80

N=4 height 72/84 35/97 73/64 74/85 37/96 76/67 71/84 37/96 72/63

M=2 adh. 91/92 77/97 88/80 90/92 74/96 88/80 90/92 73/97 87/79

N=4 height 72/84 34/97 74/64 76/85 41/96 76/67 70/84 32/97 71/62

M=3 adh. 89/92 72/97 88/79 90/92 72/97 87/79 87/91 64/97 84/75

N=4 height 72/84 32/97 74/64 75/85 38/96 76/66 70/84 32/97 72/62

M=4 adh. 89/91 71/96 88/79 89/91 71/96 87/78 86/90 64/97 84/75

N=5 height 66/86 33/98 69/57 66/85 36/97 72/60 67/86 35/98 70/59

M=1 adh. 88/93 77/96 87/78 87/92 75/96 87/78 89/94 77/97 88/79

N=5 height 69/86 34/97 72/61 70/86 39/96 76/64 68/86 36/97 70/61

M=2 adh. 91/94 81/98 91/82 90/94 78/97 89/80 91/94 78/98 88/80

N=5 height 68/86 31/98 72/61 72/87 39/97 76/65 67/86 34/97 69/58

M=3 adh. 90/93 77/97 88/78 90/93 77/97 88/78 88/93 70/98 85/75

N=5 height 67/86 34/97 72/60 72/87 39/97 76/64 65/85 30/97 69/57

M=4 adh. 89/93 75/97 87/77 88/93 73/97 88/77 85/92 61/98 84/74

N=5 height 68/86 30/97 72/59 74/87 39/97 76/63 67/85 32/97 71/59